蛇床子素调控LncRNA SNHG5对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

周璇 胡苏华

(随州市中心医院 1中医科，湖北 随州 441300；2神经内科一病区)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的常见并发症之一，患者早期症状为肾小球病变，随着疾病的进展逐步发展为终末期肾病，肾小管上皮细胞炎症反应、细胞凋亡与DN严重程度密切相关〔1～4〕。蛇床子素属于香豆素类物质，可减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤〔5〕。长链非编码RNA(LncRNA)在DM并发症的发生过程中可发挥重要调控作用，其中LncRNA SNHG5属于snoRNA U50与U50宿主基因外显子的成熟剪切体，高糖诱导的视网膜血管内皮细胞中SNHG5的表达水平降低，上调其表达可抑制高糖诱导的视网膜血管内皮细胞凋亡及迁移〔6〕。本研究探讨蛇床子素对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡、炎症的影响及其对SNHG5的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 南京泽朗医药提供蛇床子素；上海弘顺生物提供人肾小管上皮细胞HK-2；南京信帆生物提供Lipofectamine2000；上海吉玛制药提供si-NC、si-SNHG5、pcDNA、pcDNA-SNHG5；美国Thermo Fisher公司提供Trizol试剂、反转录与荧光定量PCR试剂；上海卡韦生物提供CCK-8试剂；美国Sigma公司提供凋亡检测试剂盒；上海信裕生物提供肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒；上海远慕生物提供白细胞介素(IL)-6检测试剂盒；美国CST公司提供兔抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体；美国Abcam公司提供二抗。

1.2方法

1.2.1实验分组 HK-2细胞培养于含有浓度为30 mmol/L葡萄糖的培养液中培养48 h〔7〕，记为高糖(HG)组。HK-2细胞培养于含有浓度为5.5 mmol/L葡萄糖的培养液中培养48 h，记为正常糖(NG)组。采用不同浓度的蛇床子素(0、1、10、100、1 000、5 000 nmol/L)培养HK-2细胞48 h〔8〕，分别记为0、1、10、100、1 000、5 000 nmol/L组。采用含有浓度为100 nmol/L蛇床子素与5.5 mmol/L葡萄糖的培养液培养细胞48 h，记为NG+蛇床子素组。采用含有浓度为100 nmol/L蛇床子素与30 mmol/L葡萄糖的培养液培养细胞48 h，记为HG+蛇床子素组。分别将pcDNA、pcDNA-SNHG5转染入HK-2细胞，加入含有浓度为30 mmol/L葡萄糖的培养液中培养48 h，分别记为HG+pcDNA组、HG+pcDNA-SNHG5组。si-NC、si-SNHG5分别转染入HK-2细胞后加入含有浓度为100 nmol/L蛇床子素与30 mmol/L葡萄糖的培养液培养细胞48 h，分别记为HG+蛇床子素+si-NC组、HG+蛇床子素+si-SNHG5组。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SNHG5的表达水平 采用Trizol法提取NG组、NG+蛇床子素组、HG组、HG+蛇床子素组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-SNHG5组、HG+蛇床子素+si-NC组、HG+蛇床子素+si-SNHG5组HK-2细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度。反转录合成cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明书配置反应体系与设置反应程序，应用美国ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪检测SNHG5(内参GAPDH)相对表达量。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力 收集各组HK-2细胞(1×106个/ml)分别接种于96孔板(100 μl/孔)，分别于培养24、48、72 h时每孔加入10 μl CCK-8试剂，于培养箱继续培养2 h后检测各孔吸光度值(OD 450 nm)。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组HK-2细胞加入预冷PBS洗涤后弃上清，将500 μl结合缓冲液加入细胞沉淀中，按照凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6的水平 收集各组HK-2细胞培养上清液，采用ELISA检测TNF-α、IL-6的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达 收集各组HK-2细胞加入400 μl放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、封闭2 h，分别孵育一抗稀释液(1∶1 000)与二抗稀释液(1∶2 000)，滴加电化学发光(ECL)显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1不同浓度的蛇床子素对HK-2细胞活力的影响 随着不同浓度的蛇床子素处理HK-2细胞，细胞活力比较无统计学意义，在蛇床子素浓度为5 000 nmol/L时于培养48 h时细胞活力明显降低(P<0.05)，在蛇床子素浓度为1 000、5 000 nmol/L时于培养72 h时细胞活力明显降低(P<0.05)，蛇床子素浓度为100 nmol/L时于培养24、48、72 h时细胞活力无明显变化，因而选用100 nmol/L蛇床子素进行后续研究，见表1。

表1 不同浓度蛇床子素对HK-2细胞活力的影响

2.2蛇床子素对高糖诱导的HK-2细胞活力、凋亡及炎症因子的影响 NG组与NG+蛇床子素组SNHG5的表达水平、细胞活力、凋亡率、Bax、Bcl-2蛋白、TNF-α、IL-6水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NG组比较，HG组SNHG5表达水平、细胞活力明显降低，凋亡率明显升高，Bax蛋白水平明显升高，Bcl-2蛋白水平明显降低，TNF-α、IL-6水平明显降低(均P<0.05)，蛇床子素可降低HG对细胞活力、凋亡及炎症因子的作用，见图1、图2、表2。

2.3SNHG5对高糖诱导的HK-2细胞活力、凋亡及炎症因子的影响 与HG组、HG+pcDNA组比较，HG+pcDNA-SNHG5组SNHG5表达明显升高，48、72 h细胞活力明显升高，凋亡率明显降低，Bax蛋白水平明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高，TNF-α、IL-6水平明显降低(均P<0.05)，见图3、表3。

1～4：NG组、NG+蛇床子素组、HG组、HG+蛇床子素组图1 Western印迹检测各组Bax、Bcl-2蛋白表达

图2 流式细胞术检测细胞凋亡

表2 蛇床子素对细胞活力和凋亡及炎症因子的影响

1～3：HG组、HG+pcDNA组、 HG+pcDNA-SNHG5组图3 SNHG5对高糖诱导的HK-2细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表3 SNHG5对细胞活力、凋亡及炎症因子的影响

2.4干扰SNHG5可逆转蛇床子素对高糖诱导的HK-2细胞活力、凋亡及炎症因子的影响 与HG+蛇床子素+si-NC组比较，HG+蛇床子素+si-SNHG5组SNHG5表达明显升高，48、72 h细胞活力明显降低，凋亡率明显升高，Bax蛋白水平明显升高，Bcl-2蛋白水平明显降低，TNF-α、IL-6水平明显升高(均P<0.05)，见图4、图5、表4。

1～4:HG组、HG+蛇床子素组、HG+蛇床子素+si-NC组、HG+蛇床子素+si-SNHG5组图4 Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达

图5 流式细胞检测细胞凋亡

表4 干扰SNHG5可逆转蛇床子素对细胞活力和凋亡及炎症因子的影响

3 讨 论

蛇床子素具有清除氧自由基等作用，其可通过抗氧化应激作用而减轻海马组织神经细胞损伤，并对睡眠剥夺大鼠的记忆功能发挥保护作用〔9〕。蛇床子素可减轻类风湿性关节炎大鼠的软骨损伤，并可抑制炎症反应〔10〕。但蛇床子素对DN的治疗效果及其可能作用机制尚未阐明。本研究结果提示，蛇床子素可促进高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖。细胞凋亡异常在多种疾病发生过程中发挥重要作用，Bcl-2/Bax比值降低可促进细胞凋亡，而比值升高可抑制细胞凋亡〔11〕。本研究结果表明，蛇床子素可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。本研究结果与相关文献报道结果相似〔12〕，进一步研究显示，蛇床子素可明显降低高糖诱导的肾小管上皮细胞中TNF-α、IL-6的水平，提示蛇床子素可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症反应。

本研究提示，蛇床子素可能通过上调SNHG5的表达从而发挥作用。研究表明SNHG5/miR-26a/SOX2信号轴增强骨关节炎中软骨细胞的增殖，并可减轻细胞损伤〔13〕。SNHG5通过上调KLF4增强脊髓损伤中星形胶质细胞和小胶质细胞活力〔14〕。SNHG5在慢阻肺中表达水平降低，并可通过miR-132/PTEN轴调控细胞凋亡及炎症反应〔15〕。本研究提示，干扰SNHG5表达可明显逆转蛇床子素对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡及炎症反应的作用。