荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体自噬的影响

贾冬雪 杜静 王书华

(1河北北方学院药学系，河北 张家口 075000；2河北华奥医院有限公司；3河北北方学院附属第一医院)

脑卒中是世界范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一，其中因脑循环血管阻塞引发的缺血性脑卒中最为常见〔1，2〕。当积极采取措施恢复脑缺血区的血流供应后，缺血脑组织反而受到更严重的二次损伤的现象称为脑缺血再灌注损伤。线粒体是存在于真核生物体内一种细胞器，在细胞多种生命调控活动中均具有至关重要作用，与脑缺血再灌注损伤具有密切关联〔3〕。血液供应恢复使得细胞产生大量的活性氧，氧化还原系统稳态被破坏，活性氧大量蓄积引发氧化应激损伤，作为活性氧主要来源和首要攻击目标的线粒体受损严重。功能异常的线粒体不仅不能为细胞提供所需的能量，还会触发线粒体凋亡通路，最终导致细胞死亡〔4〕。由此可见保证线粒体功能正常对减轻脑缺血再灌注损伤具有重要的意义。

线粒体自噬是一个选择性包裹受损线粒体形成自噬体并利用溶酶体将其降解的过程，从而避免功能异常的线粒体对细胞造成损伤〔5，6〕。但也有学者发现血液复灌可导致线粒体自噬过度激活，加重脑缺血再灌注损伤，抑制线粒体自噬对脑组织具有保护作用〔7〕。荭草苷是金莲花、荭草等中药植物中的主要有效活性成分，具有抗炎、抗血栓、抑制肿瘤生长等药理作用〔8〕。前期研究表明，荭草苷可减轻脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤，其可能与抗炎、降低兴奋性氨基酸对神经细胞毒性、抑制氧化应激损伤等机制有关〔9〕。但荭草苷是否通过调控线粒体自噬发挥神经保护作用仍不清楚，本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，探讨线粒体自噬在荭草苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级健康SD雄性大鼠，体重250～280 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(京) 2019-0010。

1.2药品与试剂 荭草苷(纯度：99.60%)，南通飞宇生物科技有限公司生产；雷帕霉素购自美国BioVision公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和钙离子(Ca2+)含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；微管相关蛋白轻链3抗体(LC3)，日本MBL公司生产；B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)/E1B-19K相互作用蛋白3抗体(BNIP3)，ABclonal公司生产；细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型1抗体(COX Ⅳ)，杭州华安生物技术有限公司生产。

1.3仪器 Tacan Safire2多功能酶标仪，奥地利Tecan公司产品；3K30 超速冷冻离心机，德国 Sigma 公司产品；FM0530多色荧光和化学发光成像系统，ProteinSimple公司产品。

1.4用线栓法制备大鼠局灶性脑中动脉阻断模型 采用改良Longa线栓法〔10〕制备MCAO模型，在缺血2 h后，慢慢拔出栓线进行血液再灌注。假手术组大鼠只分离血管，不进行插线处理。术后1 h参照Longa 5分制评分法对大鼠进行评分，评分越高，说明大鼠脑损伤越严重，评分1～3分表明 MCAO 模型的成功建立。

1.5分组与给药 将模型制备成功的大鼠随机分为：模型组、荭草苷组、荭草苷+雷帕霉素组，另取未插线的大鼠为假手术组，每组18只。荭草苷组于术后1 h和12 h腹腔注射6.48 μmol/kg荭草苷溶液2次(课题组前期研究〔11〕证明荭草苷6.48 μmol/kg剂量组对脑缺血再灌注大鼠具有较好的治疗效果)，假手术组和模型组给予同等剂量的溶剂和0.9%NaCl混合溶液。荭草苷+雷帕霉素组于术前24 h和30 min给予2.66 mg/ml雷帕霉素溶液两次〔12〕。

1.6脑缺血再灌大鼠神经功能损伤评分 再灌注24 h后，参照Zea-Longa建立的5分制评分法对各组大鼠进行神经功能缺损评分，通过观察双侧肢体肌力大小、大鼠肢体动作的协调性及探索能力，对大鼠的神经功能损伤程度做直观评估，分数越高，神经功能损伤越严重。0分：大鼠肢体运动正常，无明显行为学改变；1分：大鼠左前爪蜷曲，不能完全舒展；2分：大鼠左侧抗侧推能力明显减弱，肩内收，走路时向左侧转圈；3分：行走时向左侧倾斜摇摆不定；4分：意识模糊，不能自发行走。

1.7TTC法测定脑梗死体积 脑缺血再灌注24 h，深度麻醉后断头取脑，按照文献〔9〕操作进行染色，染色完成后正常组织为红色，而梗死部分则呈现为白色，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后拍照，用ImageJ软件分析脑梗死体积百分比。为排除脑水肿对脑梗死体积测定结果的影响，采用校正后的公式计算脑梗死体积：脑梗死体积百分比=(缺血侧对侧正常脑组织体积-缺血侧正常脑组织体积)/缺血侧对侧正常脑组织体积×100%。

1.8分光光度法测定线粒体SOD酶活性及Ca2+和MDA含量 大鼠再灌注24 h，深度麻醉后断头取脑，小心分离出缺血侧脑皮质，称取适量的脑组织，剪碎后加入线粒体分离液A(组织：线粒体分离液A=1∶10)制备匀浆液，于700 r/min，4℃条件下离心5 min，小心吸取上清液，于12 400 r/min，4℃条件下离心10 min，离心管底部沉淀即为所需的线粒体，上述操作需在4℃下进行。加入适量的线粒体裂解液(组织：裂解液=1∶2)，反应20 min后，参照测定试剂盒操作说明书测定线粒体中SOD酶活性及Ca2+和MDA含量。

1.9Western印迹测定缺血脑组织中纯化线粒体LC3和BNIP3的表达情况 前期处理同1.8，将裂解后的线粒体于13 500 r/min，4℃条件下离心10 min，上清即为所需的线粒体蛋白，测定蛋白浓度后金属浴变性制备上样样品，以COXⅣ表达为内参，通过计算目标蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BNIP3和内参的比值反映各组蛋白的表达水平。

1.10统计学处理 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能损伤评分的测定情况 假手术组肢体运动无明显改变，评分为0分；与假手术组比较，模型组出现明显肢体运动障碍，评分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，荭草苷治疗后肢体运动情况明显改善，评分显著降低(P<0.05，P<0.01)；与荭草苷组相比，荭草苷+雷帕霉素组神经功能损伤评分升高，但差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组神经功能损伤评分、脑梗死体积、SOD活性、Ca2+和MDA含量及LC3和BNIP3蛋白表达比较

2.2各组脑梗死体积的测定情况 与假手术组相比，模型组脑梗死体积显著增加(P<0.01)；与模型组比，荭草苷组脑梗死体积明显降低(P<0.05，P<0.01)；与荭草苷组相比，荭草苷+雷帕霉素组脑梗死体积显著增加(P<0.05)。见表1、图1。

图1 各组脑梗死体积

2.3各组脑组织线粒体SOD酶活性及Ca2+和MDA含量 与假手术组相比，模型组缺血侧脑组织的线粒体中SOD酶活性显著降低(P<0.01)，而MDA和Ca2+含量则明显增加(P<0.01)；与模型组相比，荭草苷组明显增强大鼠脑线粒体中SOD活性(P<0.01)，明显降低MDA和Ca2+含量(P<0.05，P<0.01)；与荭草苷组比较，荭草苷+雷帕霉素组明显降低SOD酶活性(P<0.05)，而MDA和Ca2+含量明显增加(P<0.05)。见表1。

2.4各组脑组织线粒体中LC3和BNIP3蛋白表达 与假手术组相比，模型组缺血侧脑组织的线粒体中LC3和BNIP3蛋白的相对表达量显著增加(P<0.01)；与模型组相比，荭草苷组脑线粒体中LC3和BNIP3蛋白的相对表达水平明显降低(P<0.01)；与荭草苷组相比，荭草苷+雷帕霉素能明显增加大鼠脑线粒体中LC3和BNIP3蛋白的相对表达(P<0.05)。见表1、图2。

1～4：假手术组、模型组、荭草苷组、荭草苷+雷帕霉素组图2 各组脑线粒体LC3和BNIP3蛋白表达

3 讨 论

线粒体通过氧化磷酸化为细胞提供能量同时，在活性氧(ROS)产生、钙动态平衡、细胞周期调节等生命活动中也具有至关重要的作用〔13〕。ROS是线粒体氧酸磷酸化过程的副产物，在正常生理条件下，ROS的产生和清除处于低水平动态平衡状态，并因其高反应活性参与调控细胞多种生理活动〔14〕。当脑缺血发生后，脑血管血液供应中断使得氧气和葡萄糖向脑组织输送减少，从而导致线粒体结构异常，氧化磷酸化出现障碍。再灌注期间，氧气重新输入引发的氧化应激反应是引起再灌注损伤的关键环节，线粒体在其中具有至关重要的作用〔15〕。脑缺血再灌注发生后，包括低氧、钙超载在内的多种病理因素导致线粒体氧化磷酸化发生异常，ROS呈现爆发式增长，氧化还原系统稳态失衡，线粒体内ROS大量蓄积诱发氧化应激反应，进一步加重线粒体损伤〔16〕。MDA是线粒体膜脂质过氧化的产物，其含量变化与脂质过氧化过程相对应，因此测定MDA含量可以用作反映线粒体氧化应激水平的指标〔17〕。线粒体是细胞中维持Ca2+动态平衡的重要细胞器〔18〕。缺血再灌注发生后氧化磷酸化反应障碍，Ca2+通过多种机制进入细胞内，线粒体通过钙单向转运蛋白吸收胞质内过多的Ca2+导致线粒体内Ca2+超载〔19〕。线粒体钙超载可导致线粒体通透性转换孔异常开放，线粒体内凋亡相关蛋白释放到胞质中，介导激活线粒体凋亡通路，最终导致细胞死亡〔20〕。本实验研究结果显示荭草苷可降低MCAO大鼠的神经功能评分和脑梗死体积，减轻大鼠脑组织损伤，这与王晓茹等〔12〕研究结果相吻合。此外本实验还发现荭草苷可减轻线粒体氧化应激对线粒体损伤，抑制线粒体钙超载现象，改善大鼠脑损伤后的线粒体功能，这提示荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑保护作用与抑制线粒体氧化应激和钙超载，改善线粒体功能有关。本研究还发现在原有荭草苷的基础上额外给予自噬诱导剂雷帕霉素干预后，荭草苷对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用减弱，而且相关指标结果也显示，荭草苷对线粒体功能保护作用也遭到破坏，提示荭草苷对线粒体的保护作用可能有线粒体自噬的参与。

自噬相关蛋白(Atg)8家族蛋白成员与磷脂酰乙醇胺(PE)的结合是自噬体形成的关键环节，LC3是Atg8蛋白家族的重要组成成员〔21〕。自噬发生时，LC3-Ⅰ与PE耦联形成LC3-Ⅱ，后者参与自噬体膜的延伸〔22〕。LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ被认为是自噬激活的标志，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬发生水平。BNIP3是存在于线粒体外膜上的蛋白，作为缺氧诱导因子1α的靶标，在缺血缺氧的情况下高表达。研究发现BNIP3表达上调可以介导线粒体自噬激活，其包含的LIR结构域可与LC3结合，诱导线粒体自噬发生，清除脑缺血再灌注后受损的线粒体〔23～25〕。课题组前期研究发现荭草苷可通过抑制自噬过度激活来减轻大鼠脑组织损伤〔12〕。雷帕霉素是一种常用的自噬诱导剂，通过抑制雷帕霉素靶蛋白mTOR活性诱导自噬发生，可与药物联用验证药物对自噬的作用〔26〕。研究结果显示，脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织线粒体中BNIP3和LC3的相对表达显著增加，这与杜肖〔27〕的实验结果一致。给予荭草苷治疗后BNIP3和LC3蛋白相对表达均显著降低，而在荭草苷的基础上额外给予雷帕霉素时，荭草苷对LC3和BNIP3蛋白表达的影响被逆转，进一步说明荭草苷可抑制线粒体自噬。Wu等〔28〕研究发现电针预处理可明显降低大鼠脑组织中LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达相对下降，降低脑梗死体积和含水量，而自噬诱导剂雷帕霉素逆转了电针预处理对LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达降低及神经保护作用，本实验结果与其一致。

综上所述，荭草苷可通过降低线粒体自噬过度表达来抑制线粒体氧化应激和钙超载，改善脑缺血再灌注大鼠线粒体功能损伤从而发挥脑保护作用。