基于网络药理学和分子对接探讨石斛合剂治疗糖尿病的作用机制

陈 涛，朱铭星，林诗铃，陈剑钰，张捷平，施 红，黄鸣清，郑燕芳*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

糖尿病患者以慢性高血糖为特征，继发引起机体组织、细胞损伤［1］。石斛合剂是福建中医药大学施红教授通过长期临床实践总结制定，并已成为福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂，由石斛、知母、黄芪、丹参、葛根、黄连、五味子、地龙、蒲公英、大黄等药物组成，具有清热、活血、祛毒之功效。前期临床和基础研究表明，石斛合剂治疗糖尿病及其并发症具有显著疗效，其作用可能与促进胰岛细胞增殖、保护神经系统等有关［2-3］。但由于石斛合剂成分复杂，很难从整体水平系统阐明其治疗糖尿病及其并发症的作用机制。网络药理学可通过“多成分-多靶点-多通路”模型显示药物和机体之间的联系，以整体性与系统性为特性，符合中医的整体观念［4］。故本研究利用网络药理学方法，挖掘石斛合剂在治疗糖尿病及其并发症中潜在的有效成分和作用机制。

1 方 法

1.1 石斛合剂化学成分收集及潜在靶点预测 基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com/），以口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 作为有效成分ADME 筛选条件。同时通过BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、ETCM 数据库（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）检索石斛合剂组成中药，筛选石斛合剂药物成分。同时通过中国知网数据库（CNKI）、PubMed 等网站对已有文献进行检索，筛选出同为石斛合剂的潜在活性成分作为补充。将石斛合剂活性成分整理去重后，通过PubChem 平台（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取石斛合剂潜在活性成分的2D 结构式，置入PharmMapper 平台（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中，进行潜在靶点预测。选取各化合物潜在靶点评分中的前50 个靶点，并以UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）标准化靶点名称。

1.2 糖尿病潜在作用靶点筛选及药物-疾病共同作用靶点获取 以“Diabetes Mellitus”作为关键词，在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）检索糖尿病相关靶点，将靶点的相关系数＞9.0为卡值，同时通过TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）、DrugBank 数据库（https：//go.drugbank.com/）进行疾病靶点补充，合并去重，置入UniProt 数据库标准化靶点名称，获得糖尿病相关靶点基因。将石斛合剂中药物作用靶点与糖尿病相关靶点基因进行映射，得到药物-疾病共同作用靶点。

1.3 蛋白质相互作用（PPI）网络构建 将糖尿病相关靶点基因映射到石斛合剂有效成分潜在靶点上，取两者交集绘制韦恩图，并导入STRING 平台（https：//cn.string-db.org/）构建PPI 蛋白互作网络，利用Cytoscape 3.7.2 软件进行PPI 网络图的绘制。

1.4 GO 富集分析与KEGG 通路分析 利用DAVID平台对石斛合剂-糖尿病的交集靶点进行GO 富集分析与KEGG 通路分析，将富集分析结果利用微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）作图后进行可视化分析。

1.5 成分-靶点-通路网络图构建 将KEGG 富集分析得到的通路信息通过Cytoscape 3.7.2 软件构建成分-靶点-通路的网络图，对网络图进行拓扑分析，分析石斛合剂作用于糖尿病的主要活性成分。

1.6 活性成分与靶点分子对接验证 从PubChem数据库下载主要活性成分的3D 结构文件，利用OpenBabel-2.4.1 软件将其转化为MOL2 格式文件。选定PPI 网络核心关键靶点，从PDB 数据库下载核心靶点蛋白的PDB 格式文件，再利用PyMol 软件对其进行去除配体和水分子等操作。最后将得到的成分文件和靶点文件利用AutoDockTools 1.5.6 和AutoDock Vina 软件进行分子对接，结合能越低，表示结合活性越强，通常认为结合能＜0 kcal/mol 提示分子之间具有结合活性，＜-5.0 kcal/mol 提示分子之间具有较强的结合活性［5］。利用PyMol 软件进行可视化分析。

2 结 果

2.1 石斛合剂的活性化合物筛选及靶点预测 通过TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM 数据库进行检索，同时检索文献对化学成分进行补充，最后共得到总有效成分199 个，通过PharmMapper 平台进行靶点预测，通过UniProt 数据库统一规范靶点名，删除重复值，得到活性成分潜在靶点共291 个。石斛合剂药物对应的潜在活性成分及靶点数目，见表1。

表1 石斛合剂“中药-活性成分-潜在靶点”信息

2.2 糖尿病有关靶点预测 通过GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 数据库获取糖尿病潜在疾病靶点1 030 个。将药材与疾病靶点映射后，获得74 个石斛合剂抗糖尿病的潜在作用靶点，绘制韦恩图，见图1。

图1 石斛合剂治疗糖尿病靶点韦恩图

2.3 构建PPI 网络 经STRING 平台获取石斛合剂抗糖尿病作用靶点的相互作用关系，通过Cytoscape 3.7.2 制作网络图，如图2 所示。包括73 个节点与551 条边，按照度值从大到小排序，以度值、介数、紧密度的平均数为条件，筛选PPI 网络图的核心靶点，共获得14 个核心靶点，包含白蛋白（ALB）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Akt1）、促生长因子（IGF1）、表皮生长因子受体（EGFR）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）、雌激素受体α（ESR1）、过氧化物酶体增生激活受体α（PPARA）、内皮一氧化氮合成酶（NOS3）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、血管紧张素转换酶（ACE）等，推测其在石斛合剂治疗糖尿病中具有重要地位。

图2 石斛合剂治疗糖尿病的靶点基因蛋白互作网络图

2.4 GO 功能富集分析 利用DAVID 数据库对靶点进行GO 富集分析（P＜0.05），其中，生物过程（BP）相关条目179 条，生物过程主要涉及凋亡过程的负调控、类固醇激素介导的信号通路、细胞对胰岛素的刺激反应等生物过程；分子功能（MF）相关条目58 条，分子功能包括类固醇激素受体活性、相同的蛋白质结合、药物结合等；细胞组分（CC）相关条目16 条，细胞组成包括细胞外间隙、胞外区、胞外外泌体等部位。按照显著程度进行排名，筛选各排名前10 的结果，利用微生信网站绘制柱形图，见图3。

图3 石斛合剂对于治疗糖尿病的GO 富集分析

2.5 KEGG 通路分析 利用DAVID 数据库对靶点进行KEGG 富集分析（P＜0.05），共得到80 条通路及其有关信息，选定P值较小的前20 条显著通路，利用微生信网站绘制气泡图，结果见图4。KEGG结果中FoxO 信号通路、胰岛素信号通路、PI3K/Akt信号通路等与糖尿病相关性较强，可能作为石斛合剂抗糖尿病的重要通路。

图4 石斛合剂对于治疗糖尿病的KEGG 富集分析

2.6 成分-靶点-通路网络图的构建 利用软件Cytoscape 3.7.2 构建石斛合剂“成分-靶点-通路”网络图，该网络图由291 个节点，3 736 条边构成，见图5。对网络图进行拓扑分析，以度值、介数、紧密度的平均数作为核心成分筛选条件，共筛选得到39 个核心成分。核心成分包括表小檗碱（HL8）、新隐丹参酮Ⅱ（DS48）、小檗红碱（HL7）、五味子乙素（WWZ11）、刺芒柄花素（D）、小檗碱（HL4）等。

图5 石斛合剂的成分-靶点-通路图

2.7 分子对接验证 选取出PPI网络图中度值排名前6 的核心靶点（ALB、Akt1、IGF1、EGFR、PPARG、ESR1）与成分-靶点-通路图中核心成分度值排名前3 的表小檗碱、新隐丹参酮Ⅱ、小檗红碱，利用AutoDock 软件进行结合能力预测，将活性成分与靶蛋白对接，发现除小檗红碱与PPARG 对接结合能＞-5.0 kcal/mol 外其余结合能均＜-5.0 kcal/mol，见表2。将最佳对接构象进行PyMol 可视化结果展示，以表小檗碱为例，见图6。

表2 石斛合剂治疗糖尿病的核心成分与关键靶点的分子对接结果

3 讨 论

本研究结果显示，石斛合剂可能通过FoxO 信号通路、胰岛素信号通路、PI3K/Akt 信号通路等发挥对糖尿病的治疗作用，通过对核心靶点与通路的分析，得出其主要通过调节胰岛素敏感、降低胰岛素抵抗、加速糖脂代谢等方式对糖尿病进行调控，同时还可能对糖尿病的并发症，如糖尿病认知功能障碍、改善糖尿病骨骼肌萎缩等具有治疗作用。

通过PPI 网络分析了石斛合剂成分潜在靶点与糖尿病靶点的交集靶点，得到了石斛合剂抗糖尿病的核心靶点，其中包括Akt1、IGF1、PPARG 等。其中Akt1 是Akt 基因的产物，被称为Akt 激酶，在人体中具有调节葡萄糖代谢的作用［6］。在机体缺乏胰岛素时，Akt 可通过刺激胰岛素反应型葡萄糖转运蛋白4 向质膜转移，从而诱导细胞摄取葡萄糖［7］。IGF1 名为胰岛素样生长因子，在机体中可改善葡萄糖耐量与胰岛素敏感性［8］。IGF1 还可通过IGF1/IGF1R 通路作用于甲状腺激素，加速糖脂代谢［9］。PPARG 是一个来自配体激活核激素受体家族的转录因子，它在被激活时调节多种代谢途径，包括脂质生物合成和葡萄糖代谢［10］。在多项研究中，该靶点的激活与胰岛素增敏和脂质代谢的调节直接相关［11-12］。在前期对于石斛合剂的研究中，其可以降低糖尿病大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇水平，提高胰岛素水平，提高组织摄取葡萄糖的能力，降低肝糖原的释放，并调节Wnt 信号通路减少脂肪积累，促进脂肪分解［13-14］。

图6 分子对接模式图

糖尿病脑病是糖尿病的一种常见并发症，其常表现为认知功能障碍［15］。Akt1 在人体中也具有调节神经细胞的作用，有研究证明其可通过PI3K/Akt1/mTOR/CREB 通路对阿尔茨海默病大鼠淀粉样蛋白损伤的海马神经元具有潜在的神经保护作用［16］。PPARG 也具有重要的免疫调节和神经保护作用［17］。因此，本研究预测，石斛合剂可作用于这些与代谢有密切相关的Akt1、IGF1 与PPARG 等靶点对糖尿病的糖脂代谢、胰岛素抵抗等过程进行干预，同时也可能通过PPARG 和Akt1 等靶点对其糖尿病脑病有起到治疗作用。

FoxO 信号通路是治疗糖尿病及其并发症的通路之一。该通路的一个中心调节机制是由PI3K/Akt 途径激活，从而影响胰岛素通路［18］，改善糖脂代谢和胰岛素抵抗［19］。同时还具有改善糖尿病心肌损伤［20］、改善糖尿病骨骼肌萎缩［21］、调控糖尿病认知功能障碍［22］等作用。而Akt 作为PI3K/Akt 通路成员，经研究证明在进餐后分泌胰岛素可激活该信号通路增加葡萄糖的利用，减少糖异生，调控PI3K/Akt 信号通路及其下游分子是糖尿病极有前景的治疗靶点［23］。胰岛素信号通路包括InsR/IRS-1通路或者直接独立于IRS-1 激活RAS/MAPK 通路［24］。其中IRS-1 可通过PI3K/Akt 通路起到促进胰岛素影响葡萄糖代谢与脂质代谢。胰岛素抵抗是糖尿病的原因之一，而骨骼肌胰岛素通路蛋白表达降低容易导致IR 的发生［25］。胰岛素信号通路还可以通过InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4 影响骨骼肌对于葡萄糖的摄取，改善胰岛素抵抗［26］。

通过成分-靶点-通路网络图筛选出石斛合剂治疗糖尿病核心成分包括表小檗碱、新隐丹参酮Ⅱ、小檗红碱等，其中表小檗碱和小檗红碱主要存在于黄连中，新隐丹参酮Ⅱ主要存在于丹参中。通过分子对接结果可知表小檗碱、新隐丹参酮Ⅱ、小檗红碱与核心靶点对接关系良好。PI3K/Akt 信号通路在KEGG 富集分析结果中与多条通路作用有关，该通路起到调节胰岛素分泌和血糖等作用，且分子对接结果显示石斛合剂中核心成分之一的新隐丹参酮Ⅱ与该通路成员（Akt1、IGF1、EGFR、PPARG 等）具有较强的结合活性，可将该通路作为石斛合剂抗糖尿病的主要通路进行深入研究。

糖尿病在中医学上被称为“消渴”，基本病机为阴津亏损、燥热偏盛，而石斛合剂具有滋阴益气、清热润燥、补肾活血的功效，方中石斛中润胃阴，下滋肾阴，滋而不腻；黄芪气阴双补，利水消肿；丹参能够通肾化瘀；知母和黄连清泄肺胃；五味子敛肺滋肾生津，宁心涩精；葛根升发脾胃清阳，生津止渴［27-28］。本实验筛选结果表明，该方的核心成分主要存在于丹参、黄连和五味子中，它们能够清泄肺胃、补肾化瘀、滋阴生津，在石斛合剂治疗糖尿病中起到了重要作用，成分-靶点-通路网络图筛选结果也证明了这点。

综上所述，本研究结果表明：石斛合剂可能基于FoxO 信号通路、胰岛素信号通路、PI3K/Akt 信号通路等核心信号通路，以及调控Akt1、IGF1、PPARG等重要靶点之间相互协同作用，从而发挥治疗糖尿病及其并发症的作用。