苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠延髓的保护作用

林 瑶，唐岚芳，李茜羽，黄佩珍，许 茜，王 林，袁明洲，蔡 晶*

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学修园临床医学院，福建 福州 350122）

帕金森病（Parkinson” s disease，PD）是一种中老年人常见的神经系统退行性疾病，主要临床表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直等，典型的病理变化是中脑黑质区致密部多巴胺能神经细胞的大量变性缺失，临床主要治疗方法是左旋多巴替代疗法。但已有研究表明，当患者出现典型临床症状时，黑质纹状体区域的多巴胺能神经细胞已经丢失60%～70%，而左旋多巴替代疗法只补充减少的多巴胺，并不能促进神经细胞存活，故只能减轻症状，并不能延缓病情的进展，且长期使用左旋多巴会出现多种运动并发症［1］。因此，如果能在神经细胞变性的早期给予神经保护，则可以尽可能地保护更多神经细胞，减少或者延后左旋多巴的使用，达到较好的成本-效益比。

苁蓉舒痉颗粒由肉苁蓉、制黄精、丹参、赤芍、牡丹皮等药物按比例浓缩制成，是课题组多年临床经验方。前期临床应用发现其对早期PD 患者的运动症状有一定改善作用［2］，进一步进行动物实验发现其君药肉苁蓉对PD 模型大鼠行为学及黑质区多巴胺能神经细胞凋亡均有减轻作用［3-4］。由于延髓是PD 发病过程中最早受影响的部位，本实验拟通过观察苁蓉舒痉颗粒对PD 模型大鼠延髓的影响，为PD 的早期神经保护治疗提供实验支持。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级6～7 月龄健康雄性SD 大鼠50 只，体质量（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。饲养于福建中医药大学实验动物中心，温度20～22 ℃，相对湿度60%～65%，光照/黑暗周期为12 h，饮水摄食自由。

1.2 实验药物 苁蓉舒痉颗粒由肉苁蓉6 g，制黄精12 g，丹参15 g，赤芍12 g，牡丹皮10 g 组成，由福建中医药大学附属第三人民医院提供。取苁蓉舒痉颗粒5 g 溶于100 mL 煮沸的蒸馏水中，配成浓度为50 mg/mL 的苁蓉舒痉颗粒药液，分装后置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 实验试剂 美多芭（上海罗氏制药有限公司，批号：H10930198）；鱼藤酮、葵花油（美国Sigma 公司，批号：R8875、S5007）；电镜固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G1102）；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-突触核蛋白（α-synuclein）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α，PGC-1α）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、激活型半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、β-actin 抗体（美国Abcam 公司，批号：ab51134、ab138501、ab178860、ab145641、ab32124、ab32503、ab2302、ab8226）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号：T2190、PC0020、R0010）；TH免疫组化试剂盒（福建迈新技术有限公司，批号：KIT-9720）；ECL 化学发光检测试剂盒（美国Bio-RAD 公司，批号：1705060）。

1.4 实验仪器 H-7650 透射电子显微镜（日本Hitachi 公司）；RM2235 石蜡切片机、UC6 超薄切片机、MDL 光学显微镜（德国Leica 公司）；ELX800 多功能酶标仪（美国Bio-TEK 公司）；Universal Hood Ⅱ化学发光成像仪、PowerPac Basic 电泳仪、PowerPac Basic转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；Motic Med 6.0 组织细胞图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司）。

2 方 法

2.1 模型建立及评价 PD模型制备采用SHERER［5］创立的经典方法：将鱼藤酮溶于葵花油乳化液，配置终浓度为1.5 mg/mL 的鱼藤酮葵花油乳化液，按1.5 mg/（kg·d）于大鼠颈背部进行皮下注射，连续注射14 d。观察大鼠的行为学改变，参照VOITENKO［6］的行为学评分标准进行评分，2～8 分者为合格的PD 模型大鼠。

2.2 动物分组及干预 将50 只健康SD 大鼠随机分为对照组10 只和造模组40 只。造模组大鼠按“2.1”项下的造模方法建立PD 模型，对照组大鼠于颈背部皮下注射等体积葵花油。造模结束后，行为学评分1 分有3 只，10 分有7 只，予剔除，最终造模成功的大鼠共30 只。将造模成功的30 只大鼠再次随机分为模型组、苁蓉舒痉组、美多芭组，每组各10 只。苁蓉舒痉组按50 mg/（kg·d）予苁蓉舒痉药液灌胃，美多芭组按5 mg/（kg·d）予美多芭混悬液灌胃，对照组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日灌胃1 次，连续灌胃14 d。

2.3 标本采集 灌胃14 d 后各组大鼠以20%乌拉坦按5 mL/kg 腹腔注射麻醉后取材。各组取3 只大鼠心脏灌流后分离中脑黑质与延髓，4%多聚甲醛固定过夜，作石蜡包埋切片，用于免疫组化及TUNEL观察。各组另取3 只大鼠冰上迅速剥离延髓，用于超微结构观察。各组剩余4 只大鼠，待其完全麻醉后迅速断头取脑，冰盘上分离延髓，用预冷的0.9%氯化钠反复冲洗，除去组织中血液，滤纸吸干，置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白含量检测。

2.4 观察指标

2.4.1 行为学检测 观察各组大鼠每天进食、饮水、活动、精神情况，并做好记录。分别于造模后和干预第7、14 天在同一时间点对各组大鼠进行网格实验和斜板实验。① 网格实验：将大鼠以倒立姿势置于一个与地面垂直的金属网格（长80 cm、宽50 cm、格间距1 cm）中央，待其四肢抓牢网格后，开始记录大鼠从静止状态到任意一肢开始活动所需的时间，即为移动潜伏期。每只大鼠重复测3 次，每次间隔5 min。② 斜板实验：依次将各组大鼠置于覆盖了2 mm 厚橡胶垫的平板中央，注意不让大鼠前后肢抓住木板边缘，初始平板与地面夹角为25°，当大鼠在该角度的平板上停留时间≥5 s，斜板向上增加 5°；当大鼠在斜板上的静止时间＜5 s 时，记录该倾斜角度。每只大鼠重复测3 次，每次间隔5 min。

2.4.2 免疫组化检测TH 阳性细胞数 按照试剂盒说明书对上述中脑黑质石蜡切片进行免疫组化染色，200 倍显微镜下观察，以棕黄色或淡黄色颗粒染色为阳性表达。每张切片随机选取5 个视野，应用麦克奥迪组织细胞图像系统分析图片，计算TH阳性反应细胞数。

2.4.3 TUNEL 检测大鼠延髓细胞凋亡率 按试剂盒说明书将各组大鼠延髓石蜡切片进行TUNEL 染色，200 倍显微镜下观察大鼠延髓区细胞凋亡情况，TUNEL 阳性细胞核即凋亡细胞核在镜下呈现棕色，正常细胞核为蓝色。每张切片随机选取5 个视野统计TUNEL 阳性细胞及细胞总数。

细胞凋亡率＝TUNEL 阳性细胞/细胞总数×100%

2.4.4 透射电子显微镜观察大鼠延髓线粒体超微结构 将修整过的蜡块置于3%戊二醛固定液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色，透射电镜下观察延髓线粒体超微结构并摄片。

2.4.5 Western blot法检测大鼠黑质区及延髓相关蛋白表达 取相应脑组织50 mg，BCA 法测定蛋白浓度。经过蛋白变性、SDS-PAGE电泳、湿转转膜后，5%脱脂牛奶封闭1 h。加一抗α-synuclein（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、PGC-1α（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃摇床过夜。TBST 洗涤，加入二抗稀释液（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST 洗涤，ECL 显影并成像，Image Lab 4.0 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与β-actin 条带灰度值的比值做为目的蛋白相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法或Games-Howell 法，检验水准α＝0.05。

3 结 果

3.1 4 组大鼠行为学实验结果比较 与对照组比较，模型组大鼠造模后和干预7、14 d 后移动潜伏期明显缩短，斜板倾斜角度明显减小（P＜0.05）；与模型组比较，苁蓉舒痉组和美多芭组大鼠干预7、14 d后移动潜伏期明显延长，斜板倾斜角度明显增大（P＜0.05）。见表1、表2。

表1 4 组大鼠网格实验移动潜伏期比较（±s） s

表1 4 组大鼠网格实验移动潜伏期比较（±s） s

注：与对照组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别对 照 组模 型 组苁蓉舒痉组美多芭组造模后2.93±0.21 1.55±0.131）1.60±0.10 1.58±0.13干预7 d 2.93±0.21 1.55±0.121）2.03±0.152）2.17±0.152）干预14 d 3.03±0.21 1.53±0.131）2.60±0.202）2.67±0.232）

表2 4 组大鼠斜板实验倾斜角度比较（±s） °

表2 4 组大鼠斜板实验倾斜角度比较（±s） °

注：与对照组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别对 照 组模 型 组苁蓉舒痉组美多芭组造模后60.00±4.88 44.77±4.451）43.00±3.80 44.40±3.14干预7 d 59.43±6.78 42.47±3.201）50.43±4.072）50.33±3.232）干预14 d 60.10±5.90 42.10±3.151）55.40±4.412）56.60±3.912）

3.2 4 组大鼠中脑TH 阳性细胞数比较 与对照组比较，模型组大鼠黑质区TH 阳性细胞数明显降低；经苁蓉舒痉颗粒与美多芭干预后，黑质区TH阳性细胞数较模型组明显增多（P＜0.05）。见图1、图2。

3.3 4 组大鼠延髓神经细胞凋亡情况比较 模型组大鼠延髓神经细胞TUNEL 阳性细胞数较对照组明显增加（P＜0.05）；经苁蓉舒痉颗粒及美多芭干预后，TUNEL 阳性细胞数明显减少（P＜0.05）。见图3、图4。

3.4 4 组大鼠线粒体超微结构比较 模型组大鼠延髓线粒体肿胀，双层膜结构不清，嵴排列紊乱，部分发生断裂和空泡化；苁蓉舒痉组和美多芭组大鼠延髓大部分线粒体形态基本正常，肿胀少见，双层膜结构清晰，嵴排列相对整齐。见图5。

图1 4 组大鼠中脑黑质区TH 免疫组化图（×200）

图2 4 组大鼠中脑黑质区TH 阳性细胞数比较

图3 4 组大鼠延髓细胞凋亡率比较

图4 4 组大鼠延髓神经细胞TUNEL 染色图（×200）

图5 4 组大鼠延髓神经细胞线粒体透射电镜图（×50 000）

3.5 4 组大鼠中脑黑质区和延髓相关蛋白表达比较 与对照组比较，模型组大鼠中脑黑质区α-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax 蛋白表达明显提高（P＜0.05），延髓Bcl-2、PPARγ 和PGC-1α 蛋白明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，苁蓉舒痉组和美多芭组组大鼠中脑黑质区α-synuclein 和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表达明显降低（P＜0.05），延髓Bcl-2、PPARγ 和PGC-1α 蛋白明显提高（P＜0.05）。见图6～8。

图6 4 组大鼠中脑黑质区α-synuclein 蛋白表达比较

图7 4 组大鼠延髓Bcl-2、cleaved caspase-3、Bax 蛋白表达比较

图8 4 组大鼠延髓PPARγ、PGC-1α 蛋白表达比较

4 讨 论

中医学将PD 归入“颤证”范畴，认为其病位虽然在脑，但实则肝肾亏虚，气血不足，筋脉失养，痰瘀内生，阻滞脑络，发为颤振［7］。苁蓉舒痉颗粒中肉苁蓉为君药，补益肝肾、填精益髓；制黄精为臣药，健脾益气、滋养肾阴；丹参、赤芍、牡丹皮为佐药，祛瘀生新、清热凉血、舒痉止痛。诸药配伍，充实脑髓，濡润筋脉。课题组前期研究也证实苁蓉舒痉颗粒能减轻帕金森患者的症状，提高帕金森综合评分量表评分［2］。

BRAAK 等［8］通过尸检发现，PD 最早累及的部位是延髓，之后依次进展至桥脑、中脑，最后累及间脑和皮层。当患者出现典型临床症状时，延髓、中脑黑质等部位均已受累，且多巴胺神经细胞丢失超过60%。本实验应用网格实验评估各组大鼠肌肉僵直状态，移动潜伏期越短说明肌肉越僵直；应用斜板实验评估大鼠的运动协调能力，斜板倾斜角度越大表示运动协调能力越强。TH 阳性神经细胞数可反映脑内存活的多巴胺能神经元的数量，而αsynuclein 的过度堆积是PD 的重要病理特征，二者均为PD 动物模型造模是否成功的重要标志。本实验结果显示，与对照组比较，模型组大鼠移动潜伏期缩短，斜板倾斜角度减小，黑质区TH 阳性细胞数减少，α-synuclein 蛋白表达提高，提示造模成功；与模型组比较，苁蓉舒痉组大鼠移动潜伏期延长，斜板倾斜角度增加，黑质区TH 阳性细胞数增加，αsynuclein 蛋白表达降低，且与阳性对照的美多芭组比较差异无统计学意义，提示苁蓉舒痉颗粒能改善PD 模型大鼠肌肉僵直状态和运动协调能力，保护神经细胞，对PD 模型大鼠具有治疗作用。

线粒体功能障碍是PD 多巴胺能神经细胞凋亡的核心机制，PPARγ 及其辅助激活因子PGC-1α 是重要的细胞分化转录因子，主要表达于高能量需求且富含线粒体的组织中，如脑、脂肪组织、心脏、肝脏等，广泛参与线粒体生物合成及能量代谢［9］。PGC-1α作为PPARγ 的辅助激活因子，与PPARγ 相结合，能调节脑组织线粒体基因表达，促进线粒体氧化磷酸化，维持线粒体形态，从而正性调节线粒体功能与代谢［10］。本实验发现，苁蓉舒痉干预后，线粒体肿胀、嵴排列紊乱、断裂等现象较模型组有所缓解，PPARγ、PGC-1α 的蛋白表达量有明显增加，延髓神经细胞凋亡率明显下降，提示苁蓉舒痉颗粒可能通过提高延髓PPARγ、PGC-1α 表达来保护线粒体结构，从而保护神经细胞。

中医学讲求“辨证论治”和“整体观念”，具有毒副作用相对较小的优势，中西医结合治疗PD，可以减少或者延后西药的使用。本实验采用经典的鱼藤酮PD 模型，主要病理损伤在黑质纹状体，实验中发现其延髓神经细胞也会出现一定损伤，苁蓉舒痉颗粒可通过提高延髓PPARγ、PGC-1α 表达来保护线粒体结构，为苁蓉舒痉颗粒应用于早期PD 的治疗提供了理论基础与依据。