基于网络药理学及动物实验探讨瑞香狼毒治疗RA作用机制

胡伊力格其，白小红，白梅荣，包文双，胡和珠拉，拉喜那木吉拉

(1.内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学 蒙医药研发工程教育部重点实验室，内蒙古 通辽 028000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发病发展主要涉及免疫、环境、炎症因子、肠道菌群等多方面因素[1-2].本病在临床上具有高致残率、高复发率、服药周期长等特点[3]，多见于中年女性[4]，RA发病机制复杂，尚无特效治疗，该病有“不死癌症”之称[5].目前RA主要用糖皮质激素和非甾体类等西药治疗[6]，西药治疗虽然见效快，可有效消除其疼痛和炎症，服用方便，但毒副作用较大，且无法根治，对于病人来说治疗价格偏高.随着对RA发病机制的深入研究及蒙医药现代化的长久发展，从蒙医药宝库中寻找高校、低毒的抗RA药物具有重要意义.

瑞香狼毒是逐水杀粘、治痈消肿蒙药，为瑞香科植物瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)的干燥根，具有味苦、辛、性涩、动、轻、平等药性[7].研究发现瑞香狼毒主要含有萜类、木脂素类和黄酮类及香豆素类成分[8-9]，有显著的药理活性.本文通过网络药理学和动物实验相结合的方法，探讨瑞香狼毒治疗RA的作用机制，为蒙药治疗RA提供科学依据.

1 材料

1.1 方剂、药物与仪器

瑞香狼毒(批号20170629)，亳州市宏大中药饮片科技有限公司；雷公藤多苷片(批号20200502)，远大医药黄石飞云制药有限公司；Freunds完全佐剂(批号SLCC7169)，美国sigma公司；水合氯醛(150330)内蒙古古道科技有限公司；苏木素-伊红染液(20220316)，南京建成科技有限公司;TNF-a(JM-01587R2)、IL-6(JM-01597R2)、IL-1β(JM-01454R2)，内蒙古古道科技有限公司.

足趾容积测量仪(PV-200)，成都泰盟科技有限公司;台式高速离心机(TG16-WS)，长沙湘鑫仪器仪表有限公司;恒温水浴锅(HH-8)，常州荣华仪器制造有限公司;电子天平(SOP)，赛多利斯科学仪器北京有限公司;超声波(KQ5200DE)，昆山市超声仪器有限公司;酶标仪(SUNRISE)，中国上海贸易有限公司;自动组织脱水机(TP-1020)，上海新振仪器设备有限公司;电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9246A)，上海精宏试验设备有限公司;显微镜(LU-N4)，日本NKON公司;生物组织包埋机(KD-BM)，金华市科迪仪器设备有限公司.

1.2 网络药理学数据库及软件

表1为网络药理学数据库及软件.

表1 网络药理学数据库及软件

1.3 实验动物

SD大鼠，210～250 g，9周龄，SPF级，雄性，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，批号：SCXK(辽)2020-0001.动物饲养于内蒙古民族大学蒙医药学院动物实验室(室内温度20～25 ℃，湿度40%～60%)，动物实验伦理批件号：NM-LL-2019-01-06-5.

1.4 瑞香狼毒醇提取物的制备

取15 g瑞香狼毒粉碎物放入20 L圆底烧瓶中，加1.5 L体积分数95% 乙醇浸泡12 h.第2天加热回流提取，第1次加热回流4 h，取上清液备用.第2次在上述药渣中再加入1.5 L体积分数95%乙醇加热回流2 h，取上清液备用.第3次在上述药渣中加1.5 L体积分数95%乙醇加热回流2 h，取上清液，把3次取的上清液合并一起，抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇，干燥即为瑞香狼毒醇提物，冷藏备用.使用前用纯水配制成不同浓度的瑞香狼毒乙醇提取物混悬液.

2 方法

2.1 网络药理学方法

2.1.1 瑞香狼毒有效成分的筛选及预测化学成分作用靶点

通过中药系统药理学TCMSP、PubMed数据库，中药综合数据库(TCMID)及相关文献报道补充，整合收集瑞香狼毒的化学成分.通过Swiss Target Predictio、Uniprot数据库预测化学成分的作用靶点.

2.1.2 瑞香狼毒疾病靶点收集

以“Rheumatoid arthritis”为关键词，使用OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)及PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)疾病数据库，整合收集RA相关靶点.

2.1.3 瑞香狼毒治疗RA作用的靶点(交集靶点)

使用Cytoscape 3.6.1 软件，分别对瑞香狼毒成分靶点与RA疾病靶点进行相交分析，筛选出瑞香狼毒治疗RA之间相互交集的靶点.

2.1.4 蛋白相互作用(PPI)网络构建

采用STRING 数据库软件，输入交集靶点，获取人类靶蛋白相互作用的数据，构建PPI网络，将数据运用Cytoscape 3.6.1 软件进行分析，获取核心靶点，构建“瑞香狼毒药材-有效成分-核心靶点-RA”网络.

2.1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

采用DAVID数据库软件，对获取的交集靶点进行GO富集和KEGG靶点通路富集，分析瑞香狼毒RA主要相关通路及生物过程.

2.2 动物实验方法

2.2.1 动物分组、造模与给药

取SD大鼠48只，随机分6组，每组8只.除空白对照组以外，各组大鼠第1天、第7天及第14天，用0.1 mL弗氏完全佐剂注射大鼠右后足趾皮下致炎，在致炎前1 h测1次两侧后足趾容积值，致炎后每3 d测1次.第8天开始阳性对照组给雷公藤多苷片12.86 mg/kg，瑞香狼毒乙醇提取物高、中、低剂量组分别灌胃32.97、16.49、8.24 g/kg，除空白和模型以外各组连续给药21 d，末次给药后2 h，腹主动脉取血，将血样静置1 h，3 000 r/min离心15 min，收集血清在-80 ℃冰箱里保存备用.

2.2.2 观察指标与检测方法

1)足趾肿胀度和HE染色及组织病理学方法

足趾肿胀度：各组大鼠造模前、后1 h测量其后足趾肿胀度.给药组和阳性组日给药1次，空白组和模型组日给生理盐水1次.每3 d测1次大鼠后足趾肿胀度.每次连续测3次，算出平均值再把足趾肿胀进行统计学比较.

HE染色及组织病理学：末次给药后，用质量分数10%水合氯醛麻醉，取滑膜组织固定在体积分数10%甲醛溶液24 h，体积分数30%甲酸浸泡42 h脱钙，梯度脱水，后浸泡至二甲苯中，用石蜡包埋后，切成厚约4 μm切片，完成脱蜡后用苏木精-伊红进行染色，在显微镜观察损伤程度及炎性细胞浸润情况，最后进行组织学分析.

2)LISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平

将备用的血清进行溶解，按照ELISA试剂盒说明书分别检测TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子含量.

2.2.3 统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用SNK-q进行事后检验.P<0.05 为差异有统计学意义.

安康市位于陕西省东南部，属国务院公布的全国14个连片特困地区之一——秦巴山区核心地带，脱贫攻坚任务十分艰巨［1］；呈贫困体量大、贫困程度深、脱贫难度大特点。为实现2020年脱贫的目标，安康市各级政府统筹部署，攻坚克难，目前已经取得了显著的成效：贫困人口数量逐步减少，贫困农村落后的基础设施得到改善，贫困农民的生活水平有了明显提高和改善。然而，课题组成员2016—2018年在安康市多个贫困村调查时发现，当地农村还存在一个棘手难题，即已达婚龄的男青年婚恋越来越困难，具体表现在三个方面：一是可婚配的女青年少；二是婚姻支付昂贵；三是婚姻极不稳定。

3 结果

3.1 网络药理学结果

3.1.1 瑞香狼毒潜在活性成分

通过TCMSP、PubMed、中药综合数据库TCMID及相关文献报道补充，整合收集瑞香狼毒的化学成分共60个.由数据库预测得到631个靶点.使用Cytoscape 3.6.1软件绘制“药材-成分网络图”.结果见图1.

图1 药材-成分网络

3.1.2 瑞香狼毒的疾病靶点收集

通过Swiss Target Prediction及 Uniprot 数据库，整合3个疾病数据库，删除重复靶点，共得5 017个与RA有关的疾病靶点.

3.1.3 瑞香狼毒治疗RA靶点

将成分靶点与疾病靶点进行相交，得出380个交集靶点，即瑞香狼毒治疗RA的作用靶点.结果见图2.

图2 成分靶点与疾病靶点交集靶点

3.1.4 PPI网络构建

图3 PPI网络构建

3.1.5 核心靶点分析结果

Cytoscape 3.6.1 软件进行分析，得到核心靶点 84个，构建“瑞香狼毒药材-有效成分-核心靶点-RA”网络，结果见图4.

图4 药材-有效成分-核心靶点-RA网络

3.1.6. GO功能及KEGG通路富集分析

3.1.6.1 GO功能分析 通过DAVID对380 个交集靶点进行GO 富集的分析得到 165条蛋白质的分子功能，83条细胞组分，713条生物学反应，对GO富集的每个条目根据所含靶点数进行排序，GO富集的前20条结果进行可视化呈现.结果见图5和表2.

表2 主要通络排序

BP.生物信息处理过程；CC.细胞分析；MF.分子功能

3.1.6.2 KEEG通路富集分析 通过DAVID对380个交集靶点进行KEGG 靶点通路注释分析，最终得到121条KEGG信号通路，利用Omicshare 平台，对KEGG富集的每个条目根据所含靶点数(count)进行排序，结果见图6.

图6 KEGG的前20条结果可视化呈现

3.2 动物实验结果

3.2.1 模型复制结果评价及各组大鼠给药前后足趾肿胀度

与正常组比较：第7天加强造模后模型组足趾肿胀度明显增加(P<0.01).与模型组比较：给药组大鼠的足趾肿胀度明显下降(P<0.01)，其中高剂量组消肿最明显，提示蒙药瑞香狼毒具有抗炎、消肿及治疗RA疾病的作用.结果见图7.

图7 大鼠足趾肿胀度对比

3.2.2 HE染色及组织病理学比较

通过HE染色及组织病理学比较发现:正常组滑膜关节腔内被覆单层扁平细胞，滑膜下结缔组织中未见炎性细胞浸润.RA模型组中的滑膜细胞增殖肥大，呈现多层、少许绒毛状突出等炎性细胞浸润，毛细血管数量增多.相比之下，给药组关节腔改变并不显著，但滑膜细胞亦增殖肥大明显，而滑膜细胞增殖情况显著好于模型组，结缔组织内浸润的炎性细胞数量少，甚至仅见到个别淋巴细胞，毛细血管的数量也明显少于模型组.结果见图8～9.

a.正常组；b.模型组；c.阳性组；d.高剂量组；e.中剂量组；f.低剂量组

a.正常组；b.模型组；c.阳性组；d.高剂量组；e.中剂量组；f.低剂量组

3.2.3 瑞香狼毒对RA模型大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响

与正常组比较，模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)；与模型组比较，瑞香狼毒高剂量组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)，瑞香狼毒中剂量组血清中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05).瑞香狼毒低剂量组TNF-α水平表达降低(P<0.05).阳性对照组TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05).见表3.

表3 瑞香狼毒对RA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

4 讨论

RA属于全身性炎症性疑难病，其发病机制尚未明确.瑞香狼毒为临床常用蒙药，其化学成分诸多，具有抗氧化[10-11]、抑菌[12-13]、杀虫[14-16]、抗癫痫和抗惊厥[17-18]、抗肿瘤[19-22]、抗炎[23-24]、镇痛[25]、免疫调节[26]、抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞增殖[27]等作用.瑞香狼毒治疗RA疗效确切，但其作用机制不清.本研究进行了网络药理学分析及动物实验验证，探索瑞香狼毒发挥抗RA作用分子机制，以期为瑞香狼毒临床应用提供理论基础.

研究显示，瑞香狼毒能够显著降低RA模型大鼠足趾肿胀度.通过HE染色及组织病理学比较发现瑞香狼毒具有较好的抗滑膜炎症作用.网络药理学研究中共筛选出60个主要活性成分，得出380个与瑞香狼毒相关交集靶点和84个核心靶点.KEGG富集分析结果表明，瑞香狼毒抗RA主要与PI3K-AKT、MAPK和TNF信号通路相关.而ERK、JNK 和p38等为MAPK重要亚族，如LPS刺激激活后作用于各自的底物-影响多种转录因子的活性-从而调节TNF-α、IL-1β、IL-6等多种细胞因子的基因表达[28].动物实验结果表明，瑞香狼毒能够显著降低炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平.

综上所述，本研究基于网络药理学及动物实验的方法与技术，探索瑞香狼毒治疗RA的可能作用机制，发现瑞香狼毒治疗RA可能与抑制炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平相关.本研究为瑞香狼毒的抗RA作用机制研究提供了实验数据参考.