m6A甲基化修饰在肿瘤免疫中的作用及干预策略

彭彦茜 易 诚 陶丽君 王红胜

1 湘南学院基础医学院 (郴州 423000)

2 中山大学药学院 (广州 510006)

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是mRNA上丰度最高的修饰，其广泛存在于原核和真核生物中[1]。m6A 已被证明对前体或成熟mRNA的剪接、运输、定位、稳定性和翻译效率具有广泛的影响。此外，m6A修饰还参与了小RNA、lncRNA 和其他转录副产物的产生，是特异性调节 mRNA 和 miRNA基因功能的重要途径[1- 2]。

m6A 的动态修饰主要依赖于三类相关蛋白，分别是甲基化酶、去甲基化酶和识别蛋白[3]。这三类蛋白以协调一致的方式共同工作，保持细胞内m6A 的稳态。RNA m6A甲基化酶主要为METTL3/14及WTAP，其功能是将甲基供体S-腺苷甲硫氨酸上甲基转移到腺苷的N- 6位置，并催化RNA中形成m6A[4]，见图1。FTO及同属Alkb家族的ALKBH5被证实为RNA m6A去甲基化酶，可高表达于大脑、肺、肌肉及睾丸[5- 6]。m6A 识别蛋白主要是含有YTH 结构域的蛋白家族[7- 8]，分别是定位在细胞质的YTHDF1/2/3 和定位于细胞核中的YTHDC1/2等[2]。此外，在哺乳动物细胞中发现与m6A 关联的蛋白还有IGF2BP、HuR及HNRNP 等诸多识别蛋白[1]。

图1 m6A RNA修饰及其介导功能

近期研究表明，m6A修饰可以调节肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中免疫细胞的浸润、存活、分化或极化，促进肿瘤细胞的增殖和转移，进而影响免疫治疗的效果[2]。此外，m6A修饰在调控免疫细胞效应功能及相关的抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用[2]。目前，肿瘤免疫调节疗法已发展成为一种癌症治疗的有效策略，基于表观遗传学的免疫治疗新策略也被提出用于癌症治疗[2]。因此，靶向m6A甲基化修饰的干预策略在肿瘤免疫治疗中具有重要潜在价值。本文将分别从m6A在免疫细胞及肿瘤免疫治疗中作用进行阐述，从而为基于m6A甲基化修饰的肿瘤免疫治疗提供新思路。

1 m6A修饰在免疫细胞中的作用

研究表明m6A在细胞分化过程中发挥重要调控作用。细胞分化是免疫细胞成熟及发生作用的重要过程，近期研究表明m6A修饰在免疫细胞如T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等分化过程中发挥重要调控作用，从而调控免疫系统功能及其在体内的作用。

1.1 T细胞

T细胞在胸腺中发育，当其成熟后可迁移到周围器官构成适应性免疫系统的基础，根据细胞表面受体CD4或CD8分为两大类，在发生病毒感染和肿瘤细胞侵袭起重要的保护作用[9]。研究表明m6A修饰在T细胞分化和功能中具有重要调控作用。如METTL3的缺失会导致CD4+T细胞下调IL - 7介导的STAT5细胞因子信号抑制蛋白SOCS的激活，破坏T细胞的稳态和分化[10]。滤泡辅助性T细胞(T follicular helper, Tfh)是一种特化的CD4+T细胞亚群，对体液免疫至关重要[11]。在敲除METTL3的小鼠中，Tfh分化会受到严重阻碍，这可能是因为Tfh的重要特征基因Tcf7、Bcl6、Icos和CXCR5等的mRNA稳定性受METTL3调控所导致[12]。同时，在敲除METTL3的小鼠中会导致IL- 2/STAT5信号通路被抑制，调节性T细胞对效应T细胞的抑制功能丧失，从而增强TME中的抗肿瘤免疫应答[13]。此外，METTL3介导的环状RNA circIGF2BP3的m6A可通过与识别蛋白YTHDC1结合增强其环化，从而上调PKP3表达并诱发PD-L1表达上调来抑制CD8+T细胞在肿瘤组织的浸润及促进肿瘤细胞免疫逃逸[14]。以上证据表明m6A甲基转移酶METTL3对T细胞功能及分化具有重要调控作用。

除METTL3外，多项研究表明m6A修饰的其它调控蛋白METTL14、ALKBH5、YTHDF1等的失调参与了对T细胞功能的调控。Dong等人[15]的研究发现，肿瘤基质中METTL14的表达量与m6A修饰水平及CD8+T细胞的浸润呈正相关，METTL14的降低促使CD8+T细胞功能失调，最终促进肿瘤生长。小鼠模型中，T细胞METTL14缺失可使得调节性T细胞功能紊乱，从而导致自发性肠炎的显著增加[16]。在CD4+T细胞中，m6A去甲基化酶ALKBH5缺乏可导致IFN-γ和CXCL2 mRNA的m6A增加，从而降低其mRNA稳定性及蛋白表达，从而导致进入中枢神经系统的中性粒细胞减少并减缓自身免疫性脑脊髓炎症状[17]。γδ T细胞在黏膜组织稳态和免疫调节中起着至关重要的作用，近期研究发现淋巴细胞中ALKBH5缺失可导致γδ T细胞显著扩增，从而抑制胃肠道沙门伤寒菌感染，其机制可能是通过增加Notch信号元件Jagged1和Notch2等mRNA的m6A从而抑制其表达[18]。此外，Han等人报道了YTHDF1蛋白的缺失可以增强T细胞对肿瘤抗原的提呈作用，提高CD8+T细胞反应性，从而抑制小鼠肿瘤生长[17]。以上证据表明，m6A修饰在T细胞中的不同功能可能取决于细胞类型和细胞环境，其详细作用及机制仍待进一步深入研究。

1.2 B细胞

B细胞主要来源于骨髓中的造血干细胞，响应抗原刺激而分化为浆细胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要进行体液免疫。生发中心反应对产生记忆B细胞和长寿命的抗体分泌浆细胞至关重要，近期研究发现METTL14对生发中心 B细胞增殖及抗体反应至关重要，其主要机制是通过增加m6A修饰来降解负性免疫调控因子如Lax1和Tipe2的mRNA[19]。同时，METTL14的缺失可显著降低B细胞mRNA m6A甲基化，从而阻碍B细胞发育，这一研究进一步证实了RNA m6A甲基化及其调节蛋白在早期B细胞发育中的重要调节作用[20]。利用Cd19-Cre(METTL CKO)在pro-B阶段对METTL3进行条件性敲除，结果表明pro-B阶段敲除METTL3对B细胞发育和功能以及肝纤维化中B细胞的前纤维化活性的影响极小，从而提示METTL3介导的B细胞发育可能具有阶段依赖性[21]。

1.3 巨噬细胞

巨噬细胞是先天免疫的吞噬细胞系统主要参与病原体和肿瘤细胞的识别、吞噬和降解[22]。通过基于CRISPR文库系统筛选，结果发现m6A甲基转移酶在巨噬细胞活化过程发挥重要促进作用，METTL3缺失的巨噬细胞其LPS诱导产生的TNF-α显著降低，其主要机制是通过抑制Irakm基因的mRNA甲基化从而抑制TLR信号诱导的巨噬细胞活化[23]。同时，识别蛋白IGF2BP2可通过稳定TSC1和PPARγ从而调控巨噬细胞活化，其缺失可促进右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎[24]。同时，干扰素调节因子1(IFN regulatory factor-1, IRF1)可通过上调环状RNA circ_0029589的m6A甲基化从而抑制其表达，进而诱导巨噬细胞的焦亡[25]。在动脉粥样硬化过程中，RNA结合蛋白Matr3可通过募集METTL3/14甲基复合物从而增加MAPK mRNA甲基化并导致其降解，从而抑制巨噬细胞介导的炎症反应及动脉粥样硬化进程[26]。

巨噬细胞高度参与肿瘤的发生和发展，特别是TME中的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)非常具有可塑性，通常分为两种功能相反的亚型即经典激活的 M1样巨噬细胞和交替激活的 M2样巨噬细胞。M1样巨噬细胞能促炎和杀瘤，而M2样巨噬细胞发挥免疫抑制和促进肿瘤生长的功能[27]。最近研究发现，METTL3可直接甲基化STAT1的mRNA并上调其mRNA稳定性与蛋白表达，从而促进巨噬细胞的M1极化[28]。在肿瘤组织中，干扰巨噬细胞的METTL3可增强重塑肿瘤微环境中M1样和M2样TAMs的浸润，使其功能紊乱并招募调节性T细胞到肿瘤发生部位，同时METTL3缺陷小鼠对PD-1的治疗响应程度显著降低[29]。巨噬细胞缺乏METTL14可抑制CD8+T细胞抗肿瘤功能，促进肿瘤生长[30]。LncRNA-PACERR在胰导管腺癌中通过与miR- 671- 3p和m6A结合蛋白 IGF2BP2相互作用诱导肿瘤相关巨噬细胞向M2极化，促进细胞增殖、侵袭和迁移，从而促进胰腺癌的恶性进展[31]。以上证据提示m6A调节的巨噬细胞分化是肿瘤免疫治疗重要潜在靶点。

1.4 NK细胞

自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是主要的固有免疫淋巴细胞，主要介导抗病毒和抗肿瘤免疫功能[32- 33]。已有文献报道，YTHDF2介导的m6A甲基化在NK细胞免疫中的多面作用，对维持NK细胞内稳态、成熟、IL -15介导的生存以及抗肿瘤和抗病毒活性至关重要[34]。此外，Song 等人[35]观察到，METTL3在肿瘤浸润NK细胞中的表达下降，其蛋白表达水平与NK细胞中效应分子呈正相关。m6A甲基化酶METTL3和m6A结合蛋白YTHDF2均正向调节NK细胞的抗肿瘤免疫，因此m6A甲基化修饰可能是维持NK细胞抗肿瘤免疫和内稳态的重要调节因子。目前其它m6A调节蛋白对NK细胞的效应功能和调控机制尚不明确。

1.5 树突状细胞

树突状细胞(dendritic cells，DC)是重要的抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs)，在固有免疫和适应性免疫反应中有重要作用[36]。最近研究表明， METTL3在DC中的特异性缺失导致DC表型和功能成熟受损，表现为共刺激分子CD40、CD80和细胞因子IL-12的表达减少，并降低体外和体内刺激T细胞应答的能力[37]。在小鼠的DC细胞中特异性敲除METTL3可降低MHC-II、共刺激分子(CD80、CD86)和炎性因子(IFN-γ、IL-12)的表达水平，降低T细胞增殖激活能力，从而诱导小鼠心脏移植后的免疫耐受，并延长异体移植物存活时间[38]。以上证据表明METTL3有助于维持成熟DC表型特性。同时，Han等人报道了m6A结合蛋白YTHDF1负向调控抗肿瘤树突状细胞的免疫应答[39]。与野生型小鼠相比，YTHDF1缺陷小鼠表现出更高的抗原特异性CD8+T细胞抗肿瘤反应，YTHDF1-/-小鼠中PD-L1检查点被阻断，免疫治疗效果增强，提示YTHDF1可能是抗肿瘤免疫治疗的潜在靶点[39]。对于m6A调控树突状细胞作用研究亟待进一步深入探索。

2 m6A在肿瘤免疫中的作用

肿瘤微环境在肿瘤进展中起着重要作用并显著影响免疫治疗效果[40- 41]。近期研究表明，m6A在肿瘤免疫及肿瘤微环境的重塑过程发挥重要调控作用，其可能是重要的肿瘤免疫治疗潜在靶点。

2.1 m6A在肿瘤固有免疫中的作用

固有免疫指的是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，也称为非特异性免疫，其参与细胞主要有单核-巨噬细胞、DC细胞、粒细胞、NK细胞等。固有免疫细胞是肿瘤微环境的主要组成部分，它们在调节肿瘤的发生、生长、转移和对治疗的反应中起着复杂而多方面的作用。

前期研究表明m6A修饰在体内固有免疫反应如抵抗病毒感染等过程中发挥重要作用[42]。其不仅参与外源RNA的感知，也参与固有免疫信号转导相关转录物的调控[43]。在人偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)侵染的细胞中，HMPV的RNA可利用宿主细胞的甲基转移酶发生m6A甲基化修饰，从而帮助HMPV病毒逃避固有免疫检测及免疫攻击[42]。宿主细胞m6A甲基转移酶METTL3的缺失可降低SARS-CoV- 2病毒 m6A修饰，从而减少RNA病毒感受器RIG-I的识别和结合，进而增强其免疫逃逸的能力[44]。

在肿瘤微环境的固有免疫细胞中，m6A修饰可对单核-巨噬细胞、DC细胞、粒细胞、NK细胞等分化及功能产生重要调节作用，从而调控肿瘤进展。在肿瘤组织中，敲低METTL3后可以抑制由YTHDF2介导的SPRED2翻译，从而增加由ERK介导的NF-κB and STAT3活化，并促进M1/M2样肿瘤相关巨噬细胞向肿瘤组织的浸润以及肿瘤的生长转移[29]。同时，METTL3介导的m6A可促进TRAF5表达从而促进肿瘤微环境中巨噬细胞向M2 TAM转化及结直肠癌的顺铂耐药[45]。Song 等人[35]观察到肿瘤微环境通过TGF-β降低METTL3表达，从而导致NK细胞的m6A水平下降，导致SHP- 2活性降低，从而导致NK细胞增殖和分化受限、效应功能受损，对肿瘤细胞反应降低。YTHDF2缺失可抑制肿瘤微环境中NK细胞的稳态及成熟，从而抑制其抗肿瘤作用，其主要机制是通过调控Tardbp从而调控NK细胞的增殖[34]。在肝癌中, Shen等人[46]分析了来自TCGA数据库的433个肝癌样本，发现METTL3表达与DC细胞浸润肿瘤呈负相关。以上研究揭示m6A可调控肿瘤微环境中固有免疫细胞的分化及免疫应答从而调控肿瘤生长。

2.2 m6A在肿瘤特异性免疫中的作用

特异性免疫又称获得性免疫或适应性免疫，人体经后天感染或者预防接种而使机体获得的抵抗感染能力，专门用于清除特定的病原体和建立持久的免疫记忆，包括多种细胞类型之间复杂的通信，如参与细胞免疫的T细胞及体液免疫的B细胞等。肿瘤部位的适应性免疫抗性是指肿瘤通过各种策略来适应并最终逃逸机体免疫系统攻击，从而使得肿瘤细胞在体内生长转移。

m6A调节适应性免疫的机制是一个新兴的研究领域，近期研究表明其在肿瘤发生发展过程中起着关键作用。在睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumors, TGCTs)中，研究者发现肿瘤细胞中METTL3的异常表达影响免疫细胞的浸润，METTL3的表达在TGCT组织中显著下调，且其表达水平与患者生存率、肿瘤中CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞浸润水平呈正相关，提示其可能在TGCT中发挥激活肿瘤免疫应答的作用[47]。特异性敲除METTL14会诱导CD8+T细胞沿功能障碍方向分化，破坏CD8+T细胞会影响巨噬细胞清除肿瘤的功能[15]。METTL3在结直肠癌肿瘤细胞中高表达， METTL3或METTL14的缺失增加了细胞毒性CD8+T细胞，并增加了TME中IFN-γ、CXCL9和CXCL10的分泌，从而增强了肿瘤细胞对PD-1治疗的响应[48]。在宫颈癌中，METTL3在肿瘤组织中的表达远高于癌旁组织，且其表达水平与CD33+髓系衍生抑制细胞的密度呈正相关，而CD33+髓系来源的抑制细胞的密度与患者生存率差相关[49]。乳腺癌中METTL3的表达水平与患者的生存率和肿瘤内注入的CD8+T细胞、辅助性T细胞和激活的NK细胞呈负相关[50]。在头颈部鳞状细胞癌中，METTL3和HNRNPC在肿瘤组织中的高表达量比正常组织高1倍，HNRNPC与CD4 naive T细胞、CD4记忆激活T细胞和嗜酸性粒细胞浸润呈正相关[51]。 以上研究提示甲基转移酶METTL3在T细胞介导的肿瘤特异性免疫中发挥重要调控作用。

肿瘤细胞METTL14对TME免疫细胞的影响研究处于起步阶段。METTL14表达水平低预示了乳腺癌预后不良，METTL14表达水平与肿瘤中CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和DC的浸润水平呈显著正相关，而与肿瘤中调节性T细胞的浸润水平呈显著负相关，提示METTL14能激活肿瘤免疫应答[52]。该研究表明，METTL14的异常表达可通过影响免疫细胞浸润介导免疫抑制来促进肿瘤的侵袭。

3 靶向RNA m6A在肿瘤免疫治疗中的作用

在肿瘤细胞中m6A及其调控蛋白表达异常从而调控肿瘤免疫微环境及肿瘤免疫应答。目前基于m6A及其调控蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用主要包括利用m6A调控蛋白特异性抑制剂提高免疫应答、诱导TME中免疫相关细胞增强免疫应答等策略。

3.1 开发m6A调节蛋白特异性抑制剂提高肿瘤免疫应答

近年来，一系列靶向m6A调控蛋白如去甲基化酶FTO、ALKBH5及甲基转移酶METTL3的小分子抑制剂等被开发出来，其中FTO是抑制剂开发较多的靶点。在2012年至2019年期间，研究人员开发并研究了一系列FTO抑制剂，如大黄酸、甲氯芬肟酸、Radicicol、N-CDPCB、CHTB、Entacapone、2-羟基谷氨酸-酒酸(R- 2HG)、FB23、FB23- 2、CS1/CS2、Dac51等(表1)。这些FTO抑制剂在体内外均表现出显著的抗肿瘤作用，不仅抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤干细胞的自我更新，而且还可以抑制肿瘤干细胞的抗肿瘤免疫。如FTO小分子抑制剂Dac51与PD-L1单抗联用显著抑制了小鼠黑色素瘤细胞、肺癌细胞以及结肠癌细胞的成瘤性，且肿瘤完全消失的小鼠激发免疫记忆细胞应答，可抵抗10倍移植数量的小鼠结肠癌细胞的再次成瘤。其能够抑制肿瘤细胞的糖代谢途径，进而增强肿瘤浸润免疫T细胞的抗肿瘤功能，具有潜在的临床应用价值[53]。

表1 m6A 甲基化酶抑制剂

2021年，英国剑桥大学、英国Storm Therapeutics公司等开发在体内具有活性的m6A甲基化酶METTL3小分子抑制剂——STM2457，并进一步证实该抑制剂能够有效抑制急性髓系白血病发展[54]。鉴于METTL3在T细胞及多种免疫细胞中的发挥重要调控作用，其小分子抑制剂在肿瘤免疫应答中的作用亟待深入研究。

3.2 TAM是肿瘤免疫治疗的重要潜在靶点

TAMs是肿瘤微环境中促肿瘤作用中的关键成分，可在肿瘤起始、生长、血管生成、淋巴管生成、局部和远处转移发挥重要促进作用[65]。 通过将肿瘤M2巨噬细胞转化为抗肿瘤M1样表型是重要的潜在抗肿瘤治疗方式[27]。前期研究抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1可以将TAMs 重编程为 MHCIIhiTNFα+IFNγ+STAT1 依赖的免疫原性表型从而获得抗肿瘤效应[66]。前期研究提示干扰巨噬细胞的METTL3可增强重塑肿瘤微环境中M1样和M2样TAMs的浸润并降低PD-1的治疗响应程度显著降低[29]，因此活化细胞内m6A相关调控蛋白可能是提高免疫应答的有效策略。

4 总结与展望

随着研究的深入, m6A甲基化修饰及其调控相关蛋白的作用和生物学意义以及在恶性肿瘤中的调控机制均得到了较为深入的研究。研究发现m6A修饰可调节免疫细胞的激活和进入肿瘤微环境，从而影响免疫治疗的效果。因此，m6A修饰可能是肿瘤免疫治疗的重要潜在靶点。在接下来的研究中，针对m6A修饰开发肿瘤免疫治疗相关策略方向有：针对m6A调节剂的特异性高效抑制剂与免疫检查点阻滞剂相结合，开发有效的免疫治疗途径；开发针对单基因或者多基因m6A基因编辑系统，可用于增强T细胞或自然杀伤细胞的抗肿瘤免疫应答；深入阐析不同调控蛋白在肿瘤免疫微环境各类细胞分化及免疫应答阶段的特点，做到更为精准的肿瘤免疫调控及干预。

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