抗衰老蛋白Klotho对急性肾损伤中氧化应激反应的抑制作用研究进展

高丽梅，张紫怡，覃志成

1 山西医科大学第五临床医学院肾内科，太原 030000；2 山西省肾脏病重点实验室

急性肾损伤（AKI）是一组以急性肾功能减退为特征的临床综合征，具有高发病率、高病死率，是全球关注的卫生健康问题之一。研究显示，氧化应激及其全身效应在AKI 的发生发展中起着关键作用［1］。因此，找到一种针对肾细胞氧化应激的调节剂，对预防或控制AKI 的发生发展具有重要意义。Klotho 是1997 年由KURO-O 等［2］研究自发性高血压小鼠模型时发现的一种基因，当该基因缺陷时，实验小鼠会表现出生长缓慢、寿命缩短、血管钙化、骨质疏松等类似人类早衰的特征，其编码的蛋白为Klotho 蛋白，分为膜型和分泌型两种。膜型 Klotho是一种单跨膜蛋白，主要表达于肾远曲小管与近曲小管，作为成纤维生长因子23（FGF23）的共受体，参与机体磷代谢［3］。分泌型Klotho 主要存在于血液中，也有少量存在于尿液和脑脊液，可作用于骨骼、脑、心、肺等远端器官，发挥抗衰老、抗氧化、抗凋亡、抗炎及保护血管等多重生物学作用［4］。研究表明，AKI 患者存在Klotho 缺乏，并伴有氧化应激反应增强， Klotho外源性给药或过表达具有肾保护作用，其潜在机制尚不完全明确［5］。本文总结了Klotho 对AKI 中氧化应激反应的抑制作用，为临床预防和治疗AKI提供更多可能。

1 激活叉头转录因子（FoxOs）活性抑制AKI 中的氧化应激反应

FoxOs是2000年才正式发布统一命名的蛋白质家族，参与多种细胞生理过程，包括细胞增殖、细胞凋亡、活性氧（ROS）反应以及细胞周期、代谢调节等［6］，其中FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6 在人类不同组织中广泛表达。激活FoxOs 可上调诸如过氧化氢酶和含锰的超氧化物歧化酶（Mn-SOD）等多种抗氧化基因表达，进而发挥抗氧化作用［7］。研究发现，Klotho 可降低FoxOs 磷酸化水平，并促进其核易位，核FoxO 可直接与Mn-SOD 启动子结合并上调其表达，从而促进ROS 的去除，并增加对氧化应激的抵抗力［8］。

KUROSU 等［9］研究发现，Klotho蛋白作为一种循环激素，可与细胞表面受体结合抑制胰岛素/胰岛素样生长因子1（IGF-1）的细胞内信号传导，发挥其抗衰老特性。研究证实，FoxOs 是胰岛素样信号传导的下游靶标［10］。一项对秀丽线虫的遗传学研究表明，胰岛素/IGF-1 可激活PI3K/Akt 通路，抑制哺乳动物FoxOs 蛋白的线虫同源基因DAF-16 活性，由此推测Klotho 蛋白可通过激活由胰岛素/IGF-1/PI3K/Akt 信号传导负调节的FoxOs，进而发挥抗氧化应激的作用［11］。研究显示，在他克莫司（Tac）诱导的肾损伤小鼠模型中，其肾组织DNA 氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、血肌酐、磷酸化Akt、FoxO3a表达均升高， Mn-SOD 免疫反应性及其mRNA 表达均降低，而补充Klotho可逆转上述结果，进一步证实Klotho 通过负调节PI3K/Akt 信号通路，并增强FoxO3a 介导的Mn-SOD 表达，从而减轻Tac 诱导的氧化应激，发挥肾脏保护作用［12］。

此外，部分研究提出Klotho 还可通过血清和糖皮质激素诱导激酶（SGK）［13］、p53/p21［14］、β-连环蛋白［15］等途径调节FoxOs 活性，进而发挥抗氧化应激的作用。

2 激活核因子红系2 相关因子2（Nrf2）抑制AKI中的氧化应激反应

Nrf2 是一种抗氧化应激的转录因子，具有六个功能域，分为Neh1～6 结构域；当静息状态下，Neh2结构域与Kelch 样ECH 相关蛋白1（Keap1）结合，促进Nrf2 泛素化并被蛋白酶体系统降解，所以细胞内的Nrf2 一般维持在较低水平。然而，当暴露于氧化应激条件下，Keap1 失去泛素连接酶活性，导致Nrf2易位到细胞核中，并与小MAF（sMAF）家族蛋白形成异二聚体，进一步与抗氧化反应元件（ARE）的增强子序列结合，诱导一系列如血红素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、Mn-SOD 等抗氧化因子的表达［16］。

有研究通过体外高糖刺激足细胞及体内糖尿病小鼠模型诱导氧化应激实验，发现相比于对照组，Klotho高表达组总Nrf2、核Nrf2及其下游靶标如Mn-SOD 表达均升高，而这种增强作用被Nrf2 抑制剂完全抑制，这表明Klotho 诱导的抗氧化应激作用至少部分是由Nrf2信号介导的［17］。CUI等［18］通过H2O2诱导建立人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型，结果显示Klotho可激活Nrf2的核易位，并增加抗氧化酶如Mn-SOD、HO-1 活性，增强血管内皮细胞存活率，而应用PI3K 抑制剂可阻断Klotho 蛋白诱导的Nrf2/HO-1 激活和细胞保护作用。因此，Klotho 激活Nrf2 的能力主要取决于其激活PI3K/Akt信号级联的能力，从而增强细胞的抗氧化防御能力。

3 激活环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信号通路抑制AKI中的氧化应激反应

cAMP 是ATP 在腺苷酸环化酶（ACs）催化下产生的核苷酸，是第一个被发现的第二信使，主要通过蛋白激酶A（PKA）及其下游效应因子如cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）等调节各种靶基因的转录，进而参与许多生理和病理过程，在细胞信号传导中起着关键作用［19］。PKA 通常处于无催化活性状态，当与cAMP 结合时被激活，进而磷酸化许多蛋白。研究发现，当cAMP/PKA 信号通路激活时，可抑制如NOX2、NOX4（NADPH 氧化酶同源物，脉管系统ROS主要来源）等氧化剂的活性，并促进如Mn-SOD、谷胱甘肽等抗氧化因子的生成，进而减轻氧化应激损伤［20］。

一项体外实验表明，Klotho 能增加人脐静脉内皮细胞cAMP 产物，并促进Mn-SOD 表达、增强SOD活性，而应用cAMP 抑制剂后上述改变被抑制，表明Klotho可通过cAMP依赖性途径上调抗氧化剂产生，进而发挥抗氧化应激作用［21］。WANG 等［22］建立了Klotho 基因转染的大鼠主动脉平滑肌（RASM）细胞模型，结果显示相较于对照组，Klotho 转染组RASM细胞内cAMP 水平和PKA 活性增加，并且PKA 的激活是呈cAMP依赖性的，而竞争性cAMP抑制剂的应用抑制了cAMP 依赖性PKA 的活性，进而消除了Klotho 诱导的Nox2 蛋白表达抑制，提示Klotho 诱导的Nox2 蛋白表达抑制可能由cAMP/PKA 途径介导的。因此，Klotho 可通过cAMP/PKA 信号通路发挥抗氧化应激作用。

4 减轻内质网应激（ERS）抑制AKI 中的氧化应激反应

内质网（ER）是真核细胞中氧化性蛋白、脂质等合成的重要细胞器，在氧化还原平衡等方面发挥重要作用。在应激（如低氧、病原体感染、脂质累积等）条件下，ER 稳态被破坏，使未折叠和错误折叠蛋白累积，超过内质网调控能力，即触发ERS，而脂质代谢异常及大量蛋白质折叠可产生大量的ROS［23］。体内和体外研究均已证明，ERS在缺氧再灌注（I/R）诱导的肾损伤中起关键作用［24］。研究显示，ERS 可能通过激活蛋白激酶RNA 样ER 激酶（PERK）、激活转录因子6α（ATF6α）和肌醇需求酶1α（IRE1α）途径诱导氧化应激［25］。

CUI等［26］建立了H2O2诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤模型，结果发现相较于模型组，Klotho 干预组内质网相关蛋白表达下降，细胞存活率升高，而这种结果随着PI3K 抑制剂LY294002 的应用被完全逆转，提示Klotho 蛋白可明显减轻H2O2诱导的内皮细胞损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt 通路，抑制内皮细胞ERS 有关。有研究将肾毒性血清（NTS）注入小鼠体内建立肾损伤模型，结果显示相较于对照组， NTS 组尿蛋白、尿素及未折叠蛋白反应途径的主要调节因子 78 kDa 葡萄糖调节蛋白（GRP78）水平更高，提示该模型可诱导ERS，且Klotho 干预组对比NTS 组肾损伤及GRP78 含量降低，表明Klotho 的肾脏保护特性至少部分是通过ERS 调节介导的［27］。此外，陈铖等［28］通过硫酸吲哚酚（IS）诱导人脐静脉内皮细胞损伤，探讨ERS 是否参与此过程及可能的机制，结果发现与IS组比较，Klotho组ERS相关蛋白表达均降低，同时磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）上调，而Klotho 蛋白的这种作用可被AMPK通路抑制剂阻断，提示Klotho 蛋白可能通过激活AMPK 通路而改善内质网应激，从而拮抗IS 对内皮细胞的损伤作用。

5 减轻线粒体功能障碍抑制AKI 中的氧化应激反应

肾脏是人类最需要能量的器官之一，线粒体含量仅次于心脏。研究发现，线粒体功能障碍在AKI的发生发展中发挥重要作用，而内源性ROS 的主要来源是线粒体的氧化磷酸化系统，并且包括清除氧自由基的关键酶Mn-SOD 在内的抗氧化剂亦在线粒体基质中表达，从而保持氧化还原平衡［29］。当肾细胞缺血缺氧时，线粒体ROS 生成增多而抗氧化系统受损，导致肾组织受到氧化应激损伤［30］。MIAO等［31］建立了单侧肾缺血再灌注（UIRI）小鼠模型，结果发现相较于UIRI 组，Klotho 干预组ROS 水平下降，线粒体相关蛋白表达升高，同时线粒体结构的异常改变得到改善，这些结果表明Klotho 在保护肾细胞线粒体功能方面发挥着重要作用。然而目前关于Klotho 通过改善线粒体功能障碍发挥抗氧化作用的研究仍较少，具体机制有待进一步探讨。

6 促进促红细胞生成素受体（EPOR）表达抑制AKI中的氧化应激反应

促红细胞生成素（EPO）是一种由肾脏产生的糖蛋白激素，因其与血细胞表面EPOR 结合而促进造血被广泛熟知。EPOR 除表达于血细胞，也表达于非造血组织，如肾脏、心脏、大脑等。EPOR 可分为两类，一类为EPOR 的同源二聚体（EPOR）2，一类为EPOR 和β 共同受体（βCR）形成的异源二聚体（EPOR/βCR），EPO与（EPOR）2结合促进红细胞生成，而与EPOR/βCR 结合具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用［32］。有研究通过葡萄糖氧化酶（GO）培养人肾小管上皮细胞诱导氧化应激模型，结果发现 GO 确实诱导了细胞内ROS 的积累，而应用EPO 可减少ROS的产生，并提高EPOR 的膜表达，提示EPO 可通过抑制ROS 的产生来保护人肾小管上皮细胞免受氧化应激损伤，而这种保护作用是由EPOR 介导的［33］。HU 等［34］通过H2O2诱导进行了肾细胞毒性实验，结果发现Klotho 可上调肾脏EPOR 表达，放大EPO 触发的信号通路，保护肾细胞免受氧化应激损伤，相反 EPOR 缺失会导致这种作用部分被消除，这表明EPOR 是参与Klotho 细胞抗氧化应激的下游信号传导因子。

综上所述，Klotho 改善AKI 的抗氧化应激机制主要包括激活FoxOs、Nrf2、cAMP/PKA 信号通路及减轻内质网应激、减轻线粒体功能障碍、促进EPOR表达等。而参与这些过程的通路相互关联或重叠，目前了解还不够全面，有待进一步深入研究，从而为开发新型抗氧化剂提供理论基础，也为临床AKI 患者的预防和治疗提供新的思路。