提高分光光度法测定乳粉亚硝酸盐回收率的研究

屠生辉，姜顾倩妮，刘 镇，曾金红，傅春辉，钱圣楠

（绍兴市食品药品检验研究院，浙江绍兴 312000）

亚硝酸盐是一类含氮无机化合物的统称，一般默认指亚硝酸钠。亚硝酸钠是一种颜色为白色或淡黄色，状态为粉末或颗粒，易溶于水的物质，其外观及滋味都与食盐相似，主要在食品工业中作为发色剂和防腐剂使用。近年来，发生过几起食用乳粉导致的亚硝酸盐中毒的食品安全事件，成人摄入亚硝酸盐0.3 ～0.5 g 即可引起中毒，3 g 能导致死亡。6 个月以内的婴儿对亚硝酸盐特别敏感，存在患上高铁血红蛋白症的风险[1-2]。因此，乳粉中亚硝酸盐含量的检测已成为市场监督管理局每年监督抽检的固定项目。

国家标准中乳粉亚硝酸盐的检测方法主要有离子色谱法和分光光度法，其中离色谱法检测成本高，而分光光度法作为一种经典的检测方法具有应用范围广的优势，但是由于乳粉基质复杂，容易导致结果回收率偏低，影响检测准确性。有研究表明，在乳粉中进行亚硝酸盐加标实验时，对回收率结果产生影响的因素主要是维生素C 含量以及乳粉基质本身的颜色干扰，维生素C含量越高，回收率越低；基质颜色越明显，回收率也越低。因此，在测定过程中，作为本底的乳粉样品要尽量选择不含有维生素C，基质颜色干扰也要尽量的小，从而排除影响回收率测定的干扰因素[3]。另外，乳粉中的油脂和蛋白含量也会影响检测液的澄清透明度，最终影响比色结果[4]。基于此，本文将进一步优化实验操作过程，确定较优参数以提高分光光度法测定乳粉亚硝酸盐的回收率。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

7230G 可见分光光度计（上海舜宇恒平）；ME204E/02 电子分析天平（梅特勒）；HH-4 水浴锅（聚辉）。

1.2 材料与试剂

饱和硼砂溶液、乙酸，分析纯；盐酸，优级纯；亚铁氰化钾溶液，106 g·L-1；对氨基苯磺酸溶液，4 g·L-1；盐酸萘乙二胺溶液，2 g·L-1；乙酸锌溶液，106 g·L-1。

标准品：1 000 μg·mL-1亚硝酸盐标准溶液（伟业计量技术研究院）。

1.3 实验方法

1.3.1 测定原理

沉淀蛋白质、除去脂肪后的乳粉试样液中的亚硝酸盐在弱酸性环境下，能与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，而后与盐酸萘乙二胺耦合成紫红色的染料，根据吸光度在分光光度计下用外标法可测定亚硝酸盐的含量。

1.3.2 测定方法

参照《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中的第二法分光光度法进行测定[5]，通过设置提取阶段的变量因素（蛋白沉淀剂添加量、称样量），确定提高加标回收率的最优条件。

（1）取样和称量。将乳粉反复搅拌至充分混匀后，置于150 mL 具塞锥形瓶，称取适量试样，作空白管；称取同空白管等量的试样，再加0.4 mL 亚硝酸盐标准溶液（100 μg·mL-1），作为加标实验管，每组做平行样。

（2）提取。先在上述装有乳粉样品的具塞锥形瓶中加入12.5 mL 的饱和硼砂溶液作为溶液中亚硝酸盐的稳定剂，再加入150 mL 热水（70 ℃左右），混合均匀，在沸水浴中加热15 min，加热后取出置于冷水浴中冷却至室温，转移至200 mL 的容量瓶中，加入适量的亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入等量乙酸锌溶液，摇匀，作为蛋白质沉淀剂组合溶液，加水至刻度线定容，摇匀。

（3）过滤。静置30 min，用一次性滴管吸出上层脂肪，上清液用滤纸过滤，滤液备用（前30 mL 滤液弃去）。

（4）测定。移取40.00 mL 上述备用滤液于50 mL带塞比色管中，再分别按0.2 mL 的等差梯度逐步吸取0 ～1.0 mL 的亚硝酸钠标准使用液（200 μg·mL-1），按0.5 mL 的等差梯度逐步吸取1.0 ～2.5 mL 亚硝酸钠标准使用液（相当于比色管中的待测液中含有0 μg、1.0 μg、2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg 的亚硝酸钠），作为标准管与试样管。再分别加入2 mL 对氨基苯磺酸溶，混匀，静置5 min 后，各加入1 mL 盐酸萘乙二胺溶液，加水至50 mL 刻度线，充分混匀，静置15 min。取1 cm 比色杯，以零管调节零点，在波长538 nm 下测定吸光度，绘制标准曲线进行比较测算。同时做试剂空白[6]。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白沉淀剂添加量对乳粉中亚硝酸盐测定的加标回收率的影响

提取过程中分别加入4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL的亚铁氰化钾溶液，充分摇匀后，再加入对应等量乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质，每组做平行实验。如图1 所示，吸光度和亚硝酸盐含量的线性方程为y=0.022 9x+0.001 5，相关系数R2=0.999 8，线性范围为0 ～12.5 μg，根据吸光度换算出测定液中亚硝酸盐的含量。

图1 蛋白沉淀剂实验组亚硝酸盐标准曲线

由表1 可知，在称样量量级相同的情况下，添加不同的蛋白沉淀剂量会影响加标回收率的测定结果。当蛋白沉淀剂的添加量小于8 mL 时，加标回收率随着蛋白沉淀剂添加量的增加而增大；当蛋白沉淀剂的添加量大于8 mL 时，加标回收率随着蛋白沉淀剂添加量的增加改变不明显。因此，结合《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中分光光度法的蛋白沉淀剂添加量为5 mL，选择蛋白沉淀剂最接近原标准的添加量（8 mL）为实验添加量。

表1 蛋白沉淀剂添加量对检测结果的影响

2.2 称样量对乳粉中亚硝酸盐测定的加标回收率的影响

考虑到样品颜色会干扰乳粉中亚硝酸盐的测定，不同的称样量会产生不同浓度的颜色干扰情况，分别称取3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g 和10 g 试样作空白管；再分别对应称取同空白管等量的试样，再加0.4 mL 亚硝酸盐标准溶液（100 μg·mL-1）作为加标实验管，每组做平行样。按2.1 中得出的每10 g样品加入8 mL 蛋白沉淀剂溶液的比例，分别加入2.4 mL、3.2 mL、4.0 mL、4.8 mL、5.6 mL、6.4 mL、7.2 mL 和8.0 mL 标准中使用的蛋白沉淀剂溶液组合，摇匀，以沉淀蛋白质。如图2 所示，吸光度和亚硝酸盐含量的线性方程为y=0.015 7x+0.001，相关系数R2=0.999 9，线性范围在0 ～12.5 μg，根据吸光度换算出测定液中亚硝酸盐的含量。

图2 称样量实验组亚硝酸盐标准曲线

由表2 可知，当蛋白沉淀剂添加量为每10 g 样品加入8 mL 时，不同的乳粉称样量会影响加标回收率，乳粉亚硝酸盐测定的加标回收率随着称样量的增加而减少，当称样量为10 g 时，回收率降至61.32%。当称样量为5 g 时，加标实验的回收率已满足85%～105%的要求，当样品量为3 g 时，加标实验的回收率最为理想。

表2 称样量对检测结果的影响

3 结论

根据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中的第二法 分光光度法检测乳粉中的亚硝酸盐时，受乳粉基质中的维生素C、蛋白和油脂以及颜色等干扰，影响比色结果，从而影响实验加标回收率。本文通过探索实验称量过程中的称样量和提取环节的蛋白沉淀剂添加量两种变量因素，研究其对实验测定结果准确性的影响。结果表明，每10 g 乳粉样品称样量中各添加8 mL 蛋白沉淀剂组合溶液时，提取效率显著提升，且当称样量≥3 g 时，称样量的减少可以有效降低乳粉中基质颜色对吸光度测定的影响，从而提高分光光度法测定乳粉中亚硝酸盐的回收率。因此改变提取环节的蛋白沉淀剂的添加量以及样品称样量可以有效提高乳粉中亚硝酸盐测定的回收率。