基于HS-SPME-GC-MS鉴定不同树龄柚子花关键呈香物质

冯 涛，孙嘉卿，王秀敏，夏贤水，朱 霖，姚凌云*

(1.上海应用技术大学，上海 201418；2.上海市农业技术推广服务中心，上海 201103；3.上海大莲湖果业专业合作社，上海 201799)

柚子花，花期早而且比较短，一般集中在每年的3月下旬至4月下旬开放，多为花苞。原产于东南亚，在我国已有3 000多年的栽培历史，浙江、广西、广东、福建等均有栽种[1]。柚子花的花香清爽、甜美、馥郁，在我国产量巨大，是理想的香花资源[2]。柚子花作为一种常见的窨制辅料，在一些花茶的制作中有很好的应用[3]。

早期，日本的栽培技术针对水分胁迫和柚子花开花的关系有所研究[4]。近年来，福建琯溪蜜柚受到广泛关注，张利军等[5]研究了福建琯溪蜜柚的落花落果与营养物质之间的关系。叶鹏等[6]采用液液萃取和水蒸气蒸馏法对琯溪蜜柚的柚子花风味物质进行了分析，共鉴定出19种风味物质。Vivian Goh等[7]对我国和东南亚各国产的柚子不同部位进行风味分析对比，对柚子花采用脂吸法和油萃取的方法进行前处理，再分别采用顶空固相微萃取和溶剂辅助风味蒸发的方法进行分析，发现油萃取的前处理方法相对更好。不同产地柚子花中均已经被鉴定出的主要风味物质有柠檬烯、β-罗勒烯、芳樟醇、香叶醇等[8]。而针对我国华东产区的柚子花以及不同树龄对柚子花风味的影响的研究鲜见报道。

挥发性香气物质对于鲜花品质是一项重要的指标。不同种类、产地、收获季节、前处理方式等都会影响到其风味物质[9]。水蒸气蒸馏法得到的鲜花精油是最常用的鲜花香气物质的分析方法[10]。但对于一些沸点较低的易挥发性风味物质提取率相对较低。顶空固相微萃取技术(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)集采样、萃取、浓缩和进样于一体，操作简单且高效，富集效果较好[11]。气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)被广泛应用于食品挥发性成分分析的检测，具有所需样品少、分析速度快、灵敏度高等特性，并可以检测出特定的风味化合物[12]。双柱定性法旨在对样品中的极性以及非极性的挥发性风味物质进行全面的分析捕捉和验证。香气活力值(odor activity value，OAV)是挥发性物质浓度与其对应介质中气味阈值的比值，其值越大，说明该物质对呈香越重要，是关键呈香成分分析的重要手段，此方法可通过理论值的计算来表征挥发性物质香气的贡献度[13]。该研究采用顶空固相微萃取技术与气相质谱联用的方法对2种树龄的柚子花挥发性风味物质进行富集分析鉴定，采用双柱法进行准确定性，采用内标法进行相对定量，能够较为全面地对2种柚子花的风味物质进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂供试样品为上海青浦4月大树(10年树龄)和小树(5年树龄)现场采摘的柚子花，采摘后迅速密封包装，放入冷冻(-20 ℃)保藏运输于实验室，用于挥发性成分检测；1，2-邻二氯苯(100 mg/L)购于Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)公司。

1.2 仪器与设备7890B-5977B 型 GC-MS 联用仪，安捷伦科技(中国)有限公司；色谱柱 HP-Innowax(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和色谱柱DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，安捷伦科技(中国)有限公司；嗅闻仪(ODP 2)，德国 Gerstel公司。

1.3 试验方法

1.3.1柚子花中香气物质的萃取。准确称取5.0 g新鲜解冻后的柚子花，置于20 mL带有聚四氟乙烯瓶盖的顶空小瓶中，加入10 μL内标溶液(100 mg/L，1，2-邻二氯苯)，将顶空小瓶置于60 ℃的水浴中平衡20 min。使用50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取纤维头，萃取时间为30 min。在使用之前，萃取纤维头需在气相色谱仪上预处理老化30 min，进样口温度为250 ℃，使得萃取纤维头上无残留其他气味杂质。

1.3.2气相色谱-质谱联用(GC-MS)条件。采用安捷伦7890A气相色谱仪和5975C质谱检测器联用。色谱柱采用HP-Innowax和DB-5分析熔融石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。气相色谱条件：进样模式为不分流模式，进样品解吸时间为3 min，进样口解吸温度为250 ℃；载气为高纯氦气(纯度>99.999%)，恒流量为1 mL/min，溶剂延迟3 min；升温程序为50 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃保持 5 min，再以8 ℃/min升至200 ℃保持5 min，最后以3 ℃/min升至230 ℃保持3 min。质谱条件：电子电离能为70 ev；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，全扫描模式，质量扫描范围为30～450m/z。

1.3.3气相色谱-嗅闻仪(GC-O)条件及评价方法。采用安捷伦7890A气相色谱仪配置嗅闻仪，在嗅闻口对样品进行嗅闻记录。气相色谱条件同“1.3.2”，载气恒流量为 2 mL/min，气相色谱流出物以1∶1的比例分别流向质谱仪和嗅闻口。嗅闻试验由10名训练有素的专业成员(6名女性和4名男性)进行。每次嗅闻时间为50 min，并记录嗅闻到的香气物质的香气特征、香气强度和香气频率。强度计算为所有小组成员记录的平均得分。气味强度按0～10分线性强度等级评定，0表示化合物无气味，5表示中等强度，10表示极强气味。

1.3.4感官评价。根据ISO 8589—2007的指导原则和条件，在感官实验室进行感官评价。感官分析的方法采用一般描述性分析。第一步，在50 mL感官杯中制备5 g柚子花样品，由10名成员(4名男性和6名女性)组成的训练有素的感官评价小组对柚子花的香气进行嗅闻和讨论。第二步，通过嗅闻和讨论达成的初步共识(每次2 h)，小组成员就柚子花的香气描述词达成一致(甜香、果香、花香、脂肪香、青香、木香)。每个感官描述词通过对以下参考化合物的嗅闻被准确定义：石竹烯表示“甜香”的香气，右旋萜二烯表示“果香”的香气，芳樟醇表示“花香”的香气，己醛表示“脂肪香”的香气，正己醇代表“青香”的香气，β-蒎烯代表“木香”的香气。从0(感知不到)到3.0、4.0、5.0(香气适中)，再到10.0(可非常强烈感知)的0～10线性标度对应香气嗅闻强度。每个样品的感官评定试验重复3次，求平均值。

1.3.5柚子花挥发性风味物质定性。 通过在NIST数据库中匹配真实标准物的保留时间、保留指数(RI)和质谱来鉴定化合物。未知化合物的RI由C7～C30正构烷烃测定，计算公式如下[14]：

式中，tx代表挥发性风味物质的保留时间；tz代表与风味物质具有相同碳原子数的烷烃的保留时间；Z表示该风味化合物的碳原子数。

1.3.6柚子花挥发性风味物质定量。以10 μL的100 mg/L的邻二氯苯为内标计算挥发性物质的含量。计算公式如下[14]：

C=C0×V0×Ax/M×A0

式中，C0为内标物浓度(mol/L)；V0为内标物体积(μL)；Ax为挥发性物质峰面积；M为样品质量(g)。

1.3.7柚子花香气活力值(OAV)的计算。利用嗅觉活性值的公式计算柚子花香气活力值(OAV)，即OAV=C/T，其中C代表化合物的浓度；T代表该化合物在空气中的嗅觉阈值，嗅觉阈值来自文献参考[14]。OAV>1表明该化合物对香气有直接影响。一般认为，OAV值越高的挥发性化合物对柚子花香气的贡献越大。

1.4 数据处理挥发性成分种类图和风味雷达图采用Excel 2020制作。采用SPSS 22软件对检测的数据计算平均值与相对标准差。

2 结果与分析

2.1 柚子花挥发性成分组分分析大树与小树柚子花的挥发性成分的总离子流图见图1，两者出峰总体趋势较为一致，且分离效果较好。

图1 大树(a)和小树(b)柚子花的总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of pomelo flowers of big tree(a)and small tree(b)

采用双柱定性法和相对内标法对挥发性风味物质进行定性定量分析，结果如表1所示。从表1可以看出，共鉴定出44种风味物质，其中大树37种，小树29种，大树和小树共同鉴定出的风味物质22种。在2种柚子花鉴定到的风味物质共可分为8个化合物种类(醛类、酯类、烯烃类、醇类、酮类、酚类、酸类、其他)。

表1 2种不同树龄的柚子花的挥发性风味物质Table 1 Volatile flavor compounds in two pomelo flowers of different ages

醛类中，己醛、香茅醛、苯甲醛等提供青香和果香的风味物质含量较高，乙醛仅在小树柚子花中被检测到，更富有果香的柠檬醛在大树柚子中被检测到，且相对含量较高。对于酯类物质，大树柚子中的酯类物质含量和种类数都相对较高，主要体现在乙酸香叶酯、丁酸乙酯、苯甲酸甲酯和乙酸橙花酯，这几种挥发性风味物质的主要香气特征是略带花香的果香，即花果香。对于烯烃类的化合物，大树和小树的风味物质种类是相同的，其中，蒎烯和月桂烯阈值相对较低，且在大树柚子花中相对含量较高，会对大树柚子柑橘类的果香属性贡献较大。综上3个种类的风味物质看来，大树柚子的风味特征相对小树柚子来说，其果香和花香的特征香气更突出一些。对于总体占比含量较高的醇类物质来说，大树柚子的相对含量也高于小树柚子，如叶醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇、苯乙醇等。对于酮类物质，小树柚子的酮类物质的种类数和相对含量略高于大树柚子，而酮类物质在香气特征上主要是提供甜香。对于酸类物质，大树柚子和小树柚子的种类和相对含量较为相近，故在该香气分路上差异不大。大树柚子在其他类的挥发性风味物质种类数上有一定的优势。综上所述，大树柚子风味中，提供花香、果香、青香的挥发性风味物质在种类和相对含量上有一定的优势，小树柚子中提供甜香的酮类物质种类和相对含量的优势较高；大树柚子的风味更为丰富多元些。

有研究表明，在植物种植期，前3年个体开花量较少，随着树龄的增长，花的产量呈幂函数关系，且在11年左右达到稳定[15]；其营养物质与香气活性物质的积累也随树龄的增长而不断累积，使其香气丰富度有所增强。在这生长过程中，吲哚乙酸、脱落酸、玉米素赤霉素等内源激素含量的变化起着重要的作用[16]。在开花后，不仅果实的产量会随着树龄而增长[17]，果实的质量也会受到树龄的影响，在果酒酿造过程中，由于单株树木单宁含量的自然变化程度是不同的，所以其对最终风味有较大的影响[18]。综上，大树柚子风味较为丰富多元，被认为是10年树龄的柚子树在可溶性固形物含量、固酸比和VC含量累积的结果[19]。小树柚子花由于树龄较小，故风味相对单一。可能是由于小树柚子生长期间，除了产生脂肪族、 支链或芳香族的醇类、醛类、羰基化合物、酸类和酯类的氨基酸代谢途径，其脂氧合酶在脂肪酸代谢途径中也较为旺盛[20]。

续表1

2.2 柚子花挥发性成分种类分析大树及小树柚子花挥发性成分种类的占比见图2，共分为8类，这8类共同构成了柚子花的香气特征，其中烯烃类和醇类含量较高，约占总体风味成分的95%以上，其余的酯类、酮类、醛类、酸类、酚类等所占比例相对较少。

图2 2种柚子花挥发性化合物种类及占总体化合物的百分比Fig.2 Types of volatile compounds from two pemelo flowers and their in the total compounds

2.3 2种柚子花GC-O嗅闻试验用顶空固相微萃取(HS-SPME)对2种柚子花的香气物质进行了萃取吸附，并用气相色谱-嗅闻(GC-O)进行了嗅闻描述，结果见表2，从大树和小树柚子花中分别嗅闻鉴定出37和28种气味活性物质。通过计算的保留指数(RIs)、香气描述和质谱鉴定3种方式对2个样品中的香气物质进行鉴定。挥发性风味物质的香气强度(AIs)大树柚子花为1.2～9.6，小树柚子花为1.1～9.4。

表2 GC-O嗅闻结果Table 2 GC-O smell results

续表2

2.4 2种柚子花感官评价由不同树龄柚子花感官评分得分(表3)得到2种柚子花的风味感官轮廓图(图3)。感官评价结果表明，大树柚子花的花香和果香更为突出，青香也比小树柚子花得分高，而小树柚子花则在甜香的香韵结果评分较高。

表3 不同树龄柚子花感官评价得分Table 3 Sensory evaluation scores of pomelo flowers at different ages

图3 不同树龄柚子花感官评价雷达图Fig.3 Radar chart for sensory evaluation of pomelo flowers at different tree ages

2.5 柚子花挥发性物质的OAV分析挥发性风味物质对柚子花风味的贡献主要受到不同风味物质阈值的影响。阈值作为香气化合物能够被嗅闻到的最低浓度，化合物浓度与其比值得到的OAV值成为表明香气贡献程度的主要指标。该研究选取OAV值大于1的物质(被认为香气贡献值较大)，共10种，其中醇类3种、烯烃类6种、醛类1种，主要为芳樟醇、月桂烯、右旋萜二烯、蒎烯、β-罗勒烯、香叶醇、石竹烯、己醛、β-蒎烯、正己醇，见表4。除石竹烯和右旋萜二烯外，其他8种OAV值大于1的物质均在大树柚子花中OAV值更高，香气活力值更大。右旋萜二烯主要在柚子花中贡献出柑橘属性的果香以及花香，而石竹烯在浓度较低的情况下其主要风味特征为带有香蕉样的甜香。这与人工感官评价结果一致。

表4 柚子花中OAV值大于1的挥发性风味物质Table 4 Volatile flavor compounds with OAV value greater than 1 in pomelo flowers

3 结论

采用HS-SPME-GC-MS的方法从上海青浦4月的大树和小树柚子花中共鉴定到44种风味物质，其中大树37种，小树29种，大树和小树共同鉴定出的风味物质22种，香气贡献值较大的风味物质10种，均为大树和小树共有的。综合分析香气贡献值较大物质的OAV值以及各挥发性风味物质的相对含量发现，大树和小树的香气特征总体差异不大，相对而言，大树柚子花的风味特征更偏向花香和果香多一些，且香气特征更为多元丰富，小树柚子花的香气特征总体比大树柚子花甜香多一些。该研究初步明确了一种上海青浦4月大树柚子花和小树柚子花的挥发性香气成分与关键呈香物质，后续将进一步使用分子感官科学和代谢组学相结合解析柚子花的特征风味物质及其香气前体物质，也将为柚子花风味的开发提供一定的理论指导。