3种有机溶剂对普通小球藻生长特性的影响

张 恒,钟 波*,张世林,李立杰

(1.湖北省水产产业技术研究院,湖北荆州 434020；2.长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心,湖北荆州434025；3.长江大学动物科学学院,湖北荆州434025)

有机溶剂是以有机物为介质,具有脂溶性和挥发性的有机化学物质[1]。在环境污染物的水生态风险评价试验中,尤其是暴露于疏水性典型环境有机污染物的毒性试验,有机溶剂的使用更为普遍[2]。有机溶剂也具有一定的毒性,如对皮肤的原发性刺激、对中枢神经系统的非特异性抑制以及对周围神经系统、肺和心脏的特异性作用等[3],在有有机溶剂使用的毒理学试验中,对试验对象的毒性效应应该重视,因此毒理学试验中有机溶剂的种类选择及其浓度设置显得尤为重要。

浮游植物(主要是微藻)的多样性和生物量直接影响着水生生态系统的结构和功能,对水环境的平衡和稳定起着极其重要的作用[4]。大多数微藻体积小,繁殖快,适应性强,对有毒物质敏感。近年来,藻类作为水环境指示生物已被广泛应用于水安全评价和环境毒物检测中[5]。普通小球藻(Chlorellavulgaris)属绿藻门(Chorophyta)小球藻科(Chlorellaceae)小球藻属(Chlorella)[6],分布广泛,可大量繁殖形成水华,也是多污染区和中等污染区的指示生物,是一种理想的化学物质毒性受试生物[7]。该研究以普通小球藻为研究对象,分别进行3种常见有机溶剂[二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、乙醇(ethanol)、丙酮(acetone)]对其的单一毒性效应,分析并比较对其生长特性的影响,为有机溶剂在藻类毒理学研究中的应用提供基础数据和参考方法。

1 材料与方法

1.1 溶剂丙酮和乙醇购自天津市北联精细化学品开发有限公司,二甲基亚砜购自天津市科密欧化学试剂有限公司，这3种有机溶剂的基本性质如表1所示。

表1 3种有机溶剂的基本性质Table 1 Basic properties of three organic solvents

1.2 藻种及其培养普通小球藻购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。

采用BG11培养液培养,接种培养液高压灭菌,取处于对数生长期的藻种进行接种,接种藻密度为1.0×105～1.5×105cells/mL(初始OD680为0.017～0.021)。培养条件:温度为25 ℃,光暗比为12 h∶12 h,光强为5 000 lx左右。丙酮、乙醇、二甲基亚砜体积分数分别为0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、2.00%、5.00%,每组设3个重复,并设不加有机溶剂空白对照组(CK),藻液体积共300 mL,静置培养,每天定时人工摇瓶3～4次。

1.3 藻类生长效应的测定每隔24 h使用紫外-可见光分光光度计,于680 nm处检测各处理组和对照组藻培养液的光密度,连续检测8 d。利用预先测定的藻细胞密度与光密度的标准曲线计算试验样本中藻细胞密度，公式如下:

Y=84.893 1X-0.336 1(R2=1)

(1)

式中,Y为藻密度(×105cells/mL)；X为680 nm处的光密度。

1.4 比生长速率测定比生长速率(specific growth rate,SGR)[8]按一般生物学计算公式计算,公式如下:

K=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)

(2)

式中,K为比生长速率(d-1)；N2为t2的藻密度(cells/mL)；N1为t1的藻密度(cells/mL)；t代表生长时间(d)。

1.5 叶绿素a含量的测定取10 mL藻液借助抽滤装置通过0.45 μm醋酸纤维膜,真空泵压泵的压力维持在0.05 MPa,膜上多余水分抽干,将滤膜剪碎后放入加有10 mL 90%乙醇溶液的旋口刻度管中,75 ℃水浴锅中提取5 min,对其提取液进行测定,用分光光度计读取其665和750 nm处的光密度。再向提取液加入1～2滴l mol/L盐酸,酸化8 min后再次读取其665和750 nm处的光密度。根据公式(3)计算出原藻液中各叶绿素a的含量:

C(chl-a)=27.3(Ea-Eb)ve/v

(3)

式中,C(chl-a)为叶绿素a含量(μg/L)；Ea为提取液酸化前波长665和750 nm处的光密度之差,Eb为提取液酸化后波长665和750 nm处的光密度之差,ve为乙醇提取液的体积(mL),v为抽滤的水样体积(L)[9]。

1.6 溶剂NOEC值的测定利用藻类生长曲线,通过方差分析,与对照组没有显著差异的最高体积分数,可以认为是最大无影响体积分数(NOEC)。

1.7 数据处理采用Origin 8.0进行数据的图表分析,采用SPSS 20.0软件进行相关性分析。试验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析,事后检验采用Duncan方法或Dunnett’s C test对各试验组与对照组的数据进行比较。

2 结果与分析

2.1 3种有机溶剂对普通小球藻藻密度的影响由图1可知，当二甲基亚砜体积分数为0.01%～0.10%时,普通小球藻藻密度与空白对照相比无显著差异；而在体积分数0.50%～5.00%时开始表现出对藻细胞具有抑制作用,抑制率最高达61.90%,二甲基亚砜对普通小球藻NOEC为0.10%。当丙酮和乙醇体积分数为0.01%～2.00%时,对藻细胞表现出较明显的促进作用,最大促进率分别为444.84%和480.55%；当体积分数均为5.00%时,对藻细胞抑制作用明显,抑制率分别为78.78%和74.67%,丙酮和乙醇对普通小球藻NOEC值均为0.01%，表现出低浓度促进高浓度抑制的作用。

图1 3种有机溶剂对普通小球藻藻密度的影响Fig.1 Effects of three organic solvents on the density of Chlorella vulgaris

由表2可知,当二甲基亚砜体积分数0.01%～0.10%时,藻密度和比生长速率均与对照组相比差异不显著(P>0.05),其中最高藻密度4.015×105cells/mL对应的体积分数是0.05%,最高比生长速率(0.250 d-1)对应的体积分数是0.10%。乙醇和丙酮对藻密度和比生长速率的影响均呈先上升后下降的趋势,体积分数0.01%～2.00%与对照组相比增幅显著,体积分数5.00%时比生长速率有负值出现,呈负增长。

表2 3种有机溶剂对普通小球藻平均藻密度和比生长速率的影响Table 2 Effects of three organic solvents on the average algal density and growth rate of Chlorella vulgis

由表3可知,3种有机溶剂在体积分数较低时普通小球藻的生长状况符合二次方程的相关性。二甲基亚砜体积分数0.01%～0.10%时,方程系数a为正值,抛物线开口向上；丙酮、乙醇体积分数0.01%～2.00%时回归方程系数a均大于对照组,与藻密度变化趋势相同。当二甲基亚砜体积分数0.50%～5.00%,乙醇、丙酮体积分数5.00%时回归方程发生实质性改变,方程次数由二次增加为五次、六次。

表3 不同有机溶剂体积分数对普通小球藻藻密度影响与时间之间的相关性Table 3 Correlation between time and the effect of volume fraction of different organic solvents on the algal density of Chlorella vulgaris

2.2 3种有机溶剂对普通小球藻叶绿素a含量的影响试验结束测定各处理组叶绿素a含量,由图2可知,二甲基亚砜体积分数为0.01%～0.10%时,叶绿素a含量与对照组相比无显著差异；体积分数为0.50%～5.00%时,叶绿素a含量显著下降,最高抑制率达91.56%。乙醇和丙酮对叶绿素a含量的影响总体上呈先上升后下降的趋势,丙酮体积分数为0.05%～2.00%、乙醇体积分数为0.05%～0.10%时,藻细胞中叶绿素a含量显著上升；乙醇和丙酮体积分数为5.00%时均对叶绿素a含量抑制作用明显,抑制率分别为90.12%和88.88%。

图2 3种有机溶剂对普通小球藻叶绿素a含量的影响Fig.2 Effect of three organic solvents on chlorophyll-a content in Chlorella vulgis

3 讨论与结论

在生态毒理学试验中,典型疏水性环境污染物(多溴联苯醚、有机氯农药、多环芳烃等)通常需要添加有机溶剂或表面活性剂来提高溶解度,如丙酮、二甲基亚砜、吐温-80等,其中吐温-80等表面活性剂,与细胞膜相互作用,增加污染物的溶解度,低浓度对生物主体的伤害也较大[10]。而很多有机溶剂本身也有毒性,如神经毒性、血液毒性、肝脏毒性等[11]。因此,有机溶剂的种类和浓度的选择尤为重要，既要保证污染物的溶解性,又不与污染物发生反应,同时对受试生物的毒性很小。目前文献中关于二甲基亚砜或丙酮等有机溶剂用量的结论并不一致,如向昆仑等[12]以1%二甲基亚砜作为青岛大扁藻安全浓度；王摆等[13]以0.1%二甲基亚砜为球等鞭金藻和新月菱形藻无影响浓度；刘帅等[14]以1%丙酮为虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)幼体安全添加浓度；薛俊欣等[15]研究表明DMSO、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇对弓形虫增殖的安全添加浓度分别为1.0%、0.1%、1.0%和0.1%。造成差异的主要原因是有机溶剂的种类、生产厂家、纯度以及对受试对象敏感性的不同。

不同生物对同一种有机溶剂的敏感性不同,同一生物对不同有机溶剂的敏感性也不同[16]。藻类作为主要的水域初级生产者,也是水体中重要的生物环境,通常对有机质和其他污染物均表现出较强的敏感性,是水域生态系统健康评价典型的指示生物,广泛应用于各种生态学试验[17]。但由于藻类对环境因子的敏感性,在以藻类尤其微藻为受试生物的毒理学试验中,有机溶剂的使用是否对藻类产生毒性效应从而影响试验结果,应该值得重视。该试验结果显示,二甲基亚砜体积分数0.50%～5.00%时对普通小球藻的抑制作用明显,抑制率达61.90%；丙酮和乙醇体积分数均为5.00%时,抑制作用明显，抑制率分别为78.78%和74.67%。郑培忠等[18]研究发现丙酮高浓度(10%)对固氮蓝藻抑制率达92%；李玲等[19]研究表明丙酮体积分数为5.000 0%的小球藻和丙酮体积分数为0.500 0%～5.000 0%的水华微囊藻,叶绿素a显著降低,抑制率分别为88.2%和99.7%,导致藻类生长严重抑制甚至死亡。有机溶剂除对藻类以外的受试生物也有明显的毒性效应,邸亚男等[20]研究发现乙醇、异丙醇、丙酮和二甲基亚砜4种有机溶剂对斑马鱼胚胎发育均出现了不同程度形态变化，如心包水肿、出血、卵黄缺损和身体弯曲等,以DMSO致畸作用最严重。黄毅等[21]研究发现有机溶剂甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇对黄鳝碱性磷酸酶(ALP)均有一定抑制作用,其抑制作用强弱顺序为异丙醇>乙醇>甲醇>乙二醇。其毒性机理可能是有机溶剂作用于细胞膜中的磷脂双分子层或中间的蛋白层,改变膜的流动性和渗透性,导致质子和离子的渗透性突然增大,破坏细胞膜的完整性,有毒物质直接进入细胞与某些生命活动物质发生反应,导致细胞正常新陈代谢失衡,甚至死亡[22]。

该试验低浓度丙酮和乙醇(0.01%～2.00%)对普通小球藻生长有刺激效应,叶绿素a含量显著上升。藻细胞叶绿素的增强有利于减轻环境胁迫对光合作用的抑制,从而改善和提高藻类的光合能力,进行物质积累,最终显著促进藻细胞的生长[23],所以低浓度丙酮和乙醇(0.01%～2.00%)处理组的藻细胞表现出与对照相比更为优异的生长趋势,这种现状称为毒性兴奋效应[24]。一方面可能是有机化合物作为附加碳源或诱导剂刺激藻细胞的生长,也可能是诱导了部分基因的表达,增加了相应功能蛋白、胞内核酸和酶含量,抵抗了有机化合物的毒害[25]。另一方面细胞存在一定的特异性耐受机制,包括细胞膜耐受机制[26]、细胞膜上的溶剂泵出机制[27]、细胞内的有机溶剂转化和降解机制[28]等,能使细胞内有机溶剂的含量低于致死阈值,从而具有一定的耐受性。张磊等[29]研究发现低浓度(0.001和0.010 mg/L)草甘膦异丙铵盐显著促进球形棕囊藻的生长,SOD和CAT活性等生理指标有明显的刺激效应；唐学玺等[30]研究表明低浓度的对硫磷(≤1.5 mg/L)对三角褐指藻的生长有刺激作用,显著促进藻细胞蛋白质、DNA和RNA的合成；张莺脐等[31]研究表明氟苯尼考浓度低于1 mg/L时促进球等鞭金藻的生长和光合速率色素含量显著增加；张哲等[32]研究表明低剂量组 (5、10、15 mg/L)草甘膦能显著促进旋链角毛藻(Chaetoceroscurvisetus) 和盐生杜氏藻 (Dunalleliasalina)的生长。