基层兽医常用的采样监测技术

黄平全，陈 林，王杜红，钟 飞，尹念春*

（1.四川省蓬溪县农业农村局，四川 蓬溪 629100；2.四川省遂宁市农业农村局，四川 遂宁 629000）

1 血清学样品采集

血清学样品主要包括全血样品、抗凝血样品以及血清样品。

1.1 全血样品采集 全血样品主要用于分离制备血清并检测血清中的抗体，常用来评价免疫效果。采集全血样品前要了解畜禽健康状况及免疫状况，一般怀孕、发病畜禽不予采样，畜禽免疫2～3周后方可采样。采样要严格遵守《动物疫病采样技术规范》（DB51/T 949-2018），按照适时、典型、无菌、适量和生物统计的原则进行采样。用于抗体检测的全血样品，一般家畜采集5～6 mL，家禽采集3～5 mL。用于病原学检测的全血样品，采集量可适当减少一些。

家禽一般于翅下静脉采血，用静脉采血针配合真空采血管进行采样，其优点是回血快速、不易溶血、不受外界污染，缺点是除保定人员外，一般还需一人配合将静脉采血针的另一端插入到真空采血管中。也可用5 mL 一次性注射器进行采样，其优点是方便快捷，缺点是将血液转移到样品采集管时，如操作不当（如用力猛推），容易导致溶血。

采集猪全血样品，小猪一般用5～10 mL注射器采集前腔静脉血。大猪可用保定绳或保定杆保定后，采集前腔静脉血，注意每采集一头猪，要对保定绳或保定杆进行消毒。在运输车上或者其他不方便对猪进行保定的情况下，可用一次性三棱针或较粗大的针头刺破耳静脉，让血液直接滴入采血管。每采集一头猪，要更换一次三棱针或针头。

羊一般用5 mL 注射器于颈静脉采血。牛一般用三棱针或较粗大的针头刺破耳静脉，让血液直接滴入采血管，也可用腕力瞬时将针头刺入颈静脉，再套上注射器抽取血液或直接用样品采集管接取血液。在牛保定良好的情况下，可用带短粗针头的注射器在尾静脉采血。采集牛全血时，要注意防止牛侧踢伤人。

1.2 抗凝血样品采集 抗凝血样品采集方法与全血样品相同，但是需要使用抗凝管。常用抗凝剂有乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素、枸橼酸钠和草酸钠等。

进行非洲猪瘟监测时，要使用含有EDTA 的无菌采血管，否则影响实验结果。大猪采血需一猪一绳保定，绳用完销毁，否则会传播疫病。采样人员要佩戴手套，采集一头猪更换一副手套，并确保衣服不接触猪的头部。

1.3 血清分离制备 血清分离制备采用自然析出法，全血采集后，试管约45°倾斜放置，直到析出血清为止，中途不能变换倾斜角度，不能剧烈颠簸，不能置于0 ℃以下冷冻储存。一般室温下静置0.5～2 h 即可析出血清，也可放在2～8 ℃冰箱中静置，慢慢析出血清。

如急需检测或在静置下没有析出血清，可采用离心分离法。离心转速要适宜，不能过低，否则无法分离血清，转速也不宜过高，否则易导致红细胞破裂而产生溶血现象。离心机转速调至2 500～3 000 r/min，离心2～3 min 即可分离出血清，没有分离出血清的，可轻轻搅拌全血后再离心。离心时离心管要一对一对配平，对称放置，保持对称的两边重量大体一致，否则离心时离心机会发出刺耳的震动声，甚至导致离心机损坏。

2 病原学样品采集

2.1 组织样品采集 夏季应在6 h 内，冬季应在24 h内采集死亡畜禽的组织样品。一般先采集肺脏、肝脏、脾脏、扁桃体、淋巴结等实质脏器，再采集肠管、气管等。采集的脏器组织块放入无菌容器内，每块组织单独放在无菌容器中，并注明采样动物名称、采样日期、采样组织名称等。组织样品按要求采集，组织块不能过大，也不能过小，一般采成1～2 cm3的小方块为宜。

2.2 拭子样品采集 禽类常采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，采样时将棉签插入咽、腔捻转2～3圈，两个拭子一并置入盛0.8 mL 左右生理盐水或0.01 M PBS（含双抗）的1.5 mL离心管中。其他动物拭子采集类似，环境拭子的采集要注意多点位、代表性。

2.3 家畜OP 液采集 家畜口蹄疫的病原学监测需要采集OP液（食道咽部分泌物）。家畜采样前禁食12 h以上（可适量饮水），避免采样时胃内容物返出污染OP液。

OP液探杯用前彻底消毒。家畜站立保定，打开口部，将消毒探杯伸入到食道上部，随着吞咽动作进入，切勿用蛮力，避免插入气管或造成食道咽部损伤。进入后，在食道上部10 cm 左右轻轻反复移动3 次，再将探杯拉出。若采集的样品有胃内污染物，需用清水或生理盐水清洗家畜口腔后重新采样。采样后，将探杯采集到的OP 液倒入带盖的灭菌离心管中（离心管事前加入10 mL的PBS液，用PBS冲洗探杯并倒入离心管内）。离心管密封、摇匀、编号后放入冷藏箱或冰箱中冷冻保存，尽快送检，如不能及时送检，应置于-30 ℃冷冻保存。

探杯使用后彻底消毒，每头家畜采样后都要进行清洗消毒，防止污染导致实验数据不准确。应经常检查探杯质量，避免探杯断裂进入动物体内或探杯损坏对动物造成损伤。

3 牛结核病监测

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，奶牛的易感性较高。诊断牛结核病常采用结核菌素（PPD）皮内变态反应试验，应严格按照《动物结核病诊断技术》（GB/T 18645-2020）进行结核病监测。出生20 d 的牛即可采用牛型PPD 进行试验，皮内注射时，斜直进针后回抽针芯，若有回血，表明针头刺入血管内，此时应稍拔针，不见回血时再注射结核菌素。注射应缓慢，拔针后应无液体渗出。阴性牛和疑似反应牛于注射后96 h 和120 h再各观察一次，以防个别牛出现迟发型变态反应。判为可疑反应的，42 d 后进行复检，结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。

4 采样注意事项

4.1 重视人员安全 开展采样和牛结核病监测工作时，人员要穿戴好口罩、乳胶手套、防护服、防护帽、胶靴等防护用品。开展布鲁氏菌病等易通过气溶胶传播的动物疫病的采样监测时还需戴上护目镜。

穿防护用品务必按照以下步骤：戴口罩—戴帽子—穿防护服—戴防护眼镜—穿鞋套或者胶鞋—戴手套。脱防护用品务必按照以下步骤：摘下防护眼镜—脱掉防护服—摘下手套—脱掉帽子—脱掉胶鞋或鞋套—摘下口罩。规范使用防护服务器才能最大限度保障人员安全。样品采集完成后，严格按照生物安全要求妥善处理相关污染物品，避免造成人畜感染和环境污染。

4.2 重视动物福利 开展畜禽样品采集和牛结核病监测要规范操作，动作轻柔，避免大力驱赶，暴力保定，减少对动物的刺激。采血时可由养殖场（户）的饲养管理人员对动物进行保定，采血人员由侧面逐渐靠近动物，采血前轻摸动物头面部，安抚情绪，尽量让动物保持安静，避免产生应激反应。进行血清学样品采集时，动物保定一定要牢靠，小畜禽保定不牢靠，不容易采集到全血，大家畜保定不牢靠，不仅不易采到血，还容易导致人员受伤。采血完毕要及时压迫止血，以免形成血肿。水禽采血后不要立即放入池塘，以防伤口感染。

4.3 规范操作 采样务必要注意样品的代表性、时效性和针对性，避免无效采样、重复采样。样品采集，特别是病原学样品采集要无菌操作，并做好样品的运输和保存，确保样品质量。监测牛结核病，牛的保定一定要牢靠，要特别注意人员安全，防止发生人员被撞伤、踩伤、压伤等安全事故。注射结核菌素，拔针后有肿胀（突起），边缘无明显浸润、无药液流出表明皮内注射成功。最好由同一人测量皮褶厚度，以免结果出入较大。