复合植物提取物对羔羊腹泻、血清免疫、炎症反应和抗氧化能力的影响

■刘凯伟 吕慧源 屠 焰 成述儒 郭春燕 刁其玉 毕研亮*

（1.中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京 100081；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；3.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102629；4.晋中职业技术学院生物工程系，山西晋中 030600）

抗生素曾作为畜牧业最主要的饲料添加剂为我国畜牧业带来了良好经济效益，但经过几十年的应用，抗生素的不利影响也被人们发现，如抗生素虽然能杀灭有害菌，抑制有害菌的繁殖，但对有益菌也有不同程度的影响。畜禽持续使用抗生素后，会导致机体的免疫力降低、机体吸收营养物质的能力下降，甚至导致机体产生抗生素耐药性[1]。耐药性可能会随着细菌不再接触抗生素而消失，但更严重的是细菌可能会将耐药基因通过质粒转移给细菌的染色体，通过无性繁殖代代相传，形成固有的耐药性[2]，并且残留在畜禽体内随着粪便的排出污染环境。根据我国农业农村部194 号公告，从2020 年7 月1 日开始禁止在饲料中添加抗生素类添加剂，在我国当前的养殖模式下，禁止使用抗生素类添加剂会对养殖业造成影响，无抗日粮不仅需要提供相应的营养，还应该满足动物肠道微生物的生长代谢需求[3]，因此寻找安全、有效的替代抗生素类饲料添加剂成为现代畜牧业急需解决的问题。植物提取物类添加剂不会使细菌产生耐药性，在畜禽体内也没有残留，已成为近几年来研究的热点。黄芪、杜仲和山茱萸都是我国药用植物，它们具有抗氧化、抗炎、促进生长、增强免疫力等优点[4]。陈祥宇等[5]研究发现复合植物提取物能够提高蛋鸡产蛋率、免疫能力与抗氧化能力。徐琪翔等[6]研究发现复合植物提取物可以提高湘东黑山羊的抗氧化能力。Sun等[7]研究发现复合植物提取物可以提高杂种石斑鱼的免疫能力。羔羊在哺乳期及断奶前后容易感染病原菌，引起羔羊腹泻，造成严重的经济损失，因此本试验目的主要研究复合植物提取物（黄芪提取物、杜仲叶提取物和山茱萸提取物）对羔羊体重、腹泻率、血清免疫、炎症和抗氧化性能的影响，旨在为羔羊日粮中添加适宜的复合植物提取物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

动物饲养试验于2021 年5 月—2021 年8 月在山东省临清市润林牧业有限公司开展。

1.2 试验材料

复合植物提取物由北京某科技公司提供，由黄芪、杜仲叶和山茱萸的提取物组成，三者的混合比例为1∶1∶1，主要成分是黄芪多糖（100 mg/g）、绿原酸（150 mg/g）和环烯醚萜苷（500 mg/g）。

1.3 试验设计

选取身体健康、体况相近且体重为（5.40±0.75）kg的15 日龄湖羊羔羊135 只，随机分为对照组与A、B、C、D组（复合植物提取物添加量分别为0.5、1.0、1.5 g/kg和2.0 g/kg）共5个处理组，每个组3个重复，每个重复9只羔羊。所有羔羊在56日龄断奶，断奶后继续饲喂至98日龄，试验期共84 d。

1.4 试验日粮及饲养管理

从15 日龄开始给羔羊饲喂开食料（开食料组成及营养水平见表1），对照组饲喂不含复合植物提取物的开食料，A、B、C、D 组饲喂不同含量复合植物提取物的开食料（复合植物提取物与开食料原料混合均匀后制作成颗粒料），所有开食料均不添加抗生素与其他添加剂。

表1 开食料组成及营养水平（干物质基础）

为了促进羔羊多采食固体饲料，从第15日龄开始训练羔羊采食开食料。断奶前，每天08：00～10：00、12：00～14：00、15：00～18：00 期间羔羊在补饲栏内采食开食料，其他时间随母羊在一起。所有羔羊均在56日龄断奶（母羊移走）。开食料由羊场的饲料厂加工，开食料为直径为3.2 mm、长度为8 mm 的颗粒饲料。试验期间，羔羊自由采食开食料和清洁饮水，试验场地为半开放式，通风和采光条件良好。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生长性能的测定

羔羊15 日龄时，早晨09：00 前，称量羔羊的体重记录为初重，试验结束时09：00前称量羔羊的体重记为末重。

1.5.2 腹泻率的测定

试验期间每天记录所有羔羊的腹泻情况，并计算羔羊的腹泻频率。

腹泻频率（%）=Σ（腹泻头数×腹泻天数）/（总头数×试验天数）×100

1.5.3 血清免疫指标的测定

在饲养试验结束时，每组选取接近本组平均体重的8只羔羊，晨饲前静脉采血20 mL，3 000 r/min离心10 min，收集血清分装于2 mL 离心管中，于-20 ℃冰箱保存。采用KHB-1280全自动生化仪（上海科华生物工程股份有限公司）测定免疫球蛋白A（Immunoglobulin A, IgA）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,IgM）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）。

1.5.4 血清炎症指标的测定

采用KHB-1280全自动生化仪（上海科华生物工程股份有限公司）测定血清中白细胞介素4（Interleukin4，IL-4）、白细胞介素6（Interleukin6，IL-6）、白细胞介素17A（Interleukin17A，IL-17A）、白细胞介素8（Interleukin8，IL-8）、白细胞介素10（Interleukin10，L-10）、白细胞介素22（Interleukin22，IL-22）、肿瘤坏死因子α（Tumour necrosis factor-α，TNF-α）、转化生长因子β（Transforming growth-factor-β，TGF-β）的含量。

1.5.5 血清抗氧化指标的测定

测定超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）活性与总抗氧化能力（Total antioxidant capacity, T-AOC）、丙二醛（Malonic dialdehyde, MDA），试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.6 数据分析

数据采用SAS 9.4 软件进行统计分析，体重和血清指标以每只羊为试验单位进行统计分析，腹泻频率以每个重复为试验单位进行统计分析。采用one way ANOVA过程进行单因素方差分析，采用Duncan，s法进行多重比较。显著性判断标准为：P＞0.05为差异不显著，P＜0.05表示为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同含量复合植物提取物对羔羊生长性能的影响

从表2 可以看出，98 日龄时，各添加剂组的羔羊体重均高于对照组，但没有显著性差异（P＞0.05）。

表2 不同处理对羔羊体重的影响（kg）

2.2 不同含量复合植物提取物对羔羊腹泻频率的影响

从表3 可以看出15～56 日龄和56～98 日龄时，各添加剂组的羔羊腹泻频率均低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同处理对羔羊腹泻指标的影响（%）

2.3 不同含量复合植物提取物对羔羊血清免疫指标的影响

从表4 可以看出C 组的IgG、IgA 和IgM 均显著高于对照组和其他试验组（P＜0.05），D 组的IgA 显著低于对照组（P＜0.05）。

表4 不同处理对羔羊血清免疫指标的影响(g/L)

2.4 不同含量复合植物提取物对羔羊血清炎症指标的影响

从表5可以看出C组血清抗炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β均显著高于对照组和其他试验组（P＜0.05），促炎细胞因子IL-6、IL-17A、IL-8、IL-22 和TNF-α均显著低于对照组和其他试验组（P＜0.05），D组的IL-17A显著高于对照组（P＜0.05）。

表5 不同处理对羔羊血清炎症指标的影响

2.5 不同含量复合植物提取物对羔羊血清抗氧化指标的影响

从表6 可以看出C 组的SOD、GSH-Px、T-AOC 均显著高于对照组和其他试验组（P＜0.05），MDA显著低于对照组和其他试验组（P＜0.05），D组的SOD、CAT显著低于对照组（P＜0.05）。

表6 不同处理对羔羊血清抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 不同含量复合植物提取物对羔羊体重的影响

幼龄羔羊处于生长发育速度和组织器官发育速度最快的时期，这段时期对养分的利用率是最高的[8]，在这段时期内，任何外界环境及营养等因素的调控都会对羔羊的生长发育造成严重影响[9]，在这段时期要形成集成型营养供给方案，无论外源和内源、常量和微量营养素，不仅要数量充足，还需要比例适当，才能充分发挥幼龄动物养分利用率高的特点[10]。冯士彬等[11]研究发现在饲料中添加的黄芪多糖可以显著提升湖羊羔羊的日增重。刘静慧等[12]研究发现在饲粮中添加2 g/kg 的绿原酸可以显著提高肉兔的体重。本次试验各复合植物提取物添加剂组的末重均高于对照组，但未产生显著性差异，可能是因为复合植物添加剂对动物生长性能的影响受年龄、物种、品种等因素的影响较大，也有可能受植物提取物添加剂添加量的影响。

3.2 不同含量复合植物提取物对羔羊腹泻的影响

幼龄羔羊因自身肠胃消化系统发育不完全，易受到外界不良刺激的侵扰，如病原体的感染、环境刺激和气味刺激等，这些刺激是导致幼龄畜禽腹泻的主要的原因之一。虽然不同的腹泻原因对羔羊的影响有一定的差异，但羔羊腹泻会对羔羊的健康发育造成危害，甚至会造成羔羊死亡。周晓情等[13]研究发现维生素A 与黄芪多糖联合使用可以改善犊牛的腹泻发病率。刘延鑫等[14]研究发现饲料中添加黄芪多糖可以减少断奶公犊的腹泻频率。张彦利等[15]研究发现在饲粮中添加复方制剂（主要成分为盐酸小柴碱和黄芪多糖）能使断奶仔猪的腹泻率显著下降。上述试验与本次试验结果相似，本次试验复合植物添加剂可以改善羔羊断奶前后的腹泻频率，可能是因为黄芪提取物中的黄芪多糖可以通过调节神经免疫网络的功能来增加机体的免疫性能[16]，黄芪多糖还可以抑制动物肠道内有害微生物的生长繁殖，增加肠道内有益微生物的含量，维持肠道菌群结构的平衡[17-18]。杜仲叶提取物中的丁香苷能抑制病原体表面多聚糖蛋白的形成[19]，绿原酸可以保护肠道微生物的多样性从而维持肠道的健康[20]，降低腹泻发生的概率。

3.3 不同含量复合植物提取物对羔羊血清免疫性能的影响

血清指标的变化在一定的程度上可以反映机体的代谢状况。其中IgG、IgA和IgM都是体液免疫的主要抗体，这些免疫球蛋白的含量能在一定的程度上反映动物机体的免疫能力。冯士彬等[11]研究发现在饲粮中添加黄芪多糖可以显著提高湖羊羔羊的IgA、IgG 和IgM含量。王宇等[21]研究发现饲粮中添加1 000 mg/kg绿原酸能显著升高断奶仔猪的血清IgG 含量。张玉霞等[22]研究发现山茱萸总苷能够显著降低IgA 含量。本试验C组的IgG、IgA、IgM含量均显著高于对照组和其他试验组，说明添加1.5 g/kg 的复合植物提取物可以显著改善羔羊的免疫性能，原因可能是黄芪可以通过促进体液免疫，刺激巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的吞噬作用，增强自然杀伤（NK）细胞的活性来增强机体的免疫能力[23]。杜仲多糖可通过抑制TOLL受体4介导的信号通路来减轻炎症反应[24]。山茱萸新苷能抑制淋巴细胞转化、NK 细胞的生成和IL-2的产生来增强机体免疫能力[25]。另外，研究发现当每头泌乳奶牛绿原酸添加剂达到200 g/d时，会对泌乳奶牛营养物质的消化产生不利影响[26]。植物提取物对反刍动物的剂量受年龄、品种和性别等因素的影响，本试验D 组羔羊的IgA 显著低于对照组，可能是因为植物提取物的添加量超过了幼龄羔羊的耐受剂量，降低了羔羊的免疫能力，但对羔羊的生长性能没有影响。

3.4 不同含量复合植物提取物对羔羊炎症指标的影响

动物的免疫系统是动物机体抵抗外部入侵的重要屏障，对动物健康生存拥有重要意义[27]，而免疫系统一旦失衡极易引起机体的炎症反应，炎症反应是以血管为中心发生的病理过程，其中IL-4、IL-10 和TGF-β等能减轻炎症反应被称为抗炎因子，而IL-6、IL-17A、IL-8、IL-22和TNF-α等能促进炎症反应称为促炎因子。鲍玉林等[28]研究发现在饲粮中添加0.1 g/kg的黄芪多糖可以显著降低滩羊血清中的IL-2 的含量。周博文[29]研究发现在饲粮中添加20 mL蒲公英绿原酸提取液可以显著提高犊牛血清中IL-6 和IL-10的含量。本次试验C 组的IL-4、IL-10 和TGF-β均显著高于对照组和其他试验组，IL-6、IL-17A、IL-8、IL-22 和TNF-α均显著低于对照组和其他试验组，说明1.5 g/kg的复合植物提取添加剂可以显著提高羔羊对炎症反应的抵抗能力。原因可能是因为黄芪多糖可以激活β-酪蛋白的表达，抑制细胞中促炎性因子的分泌[30]，还可以抑制细胞凋亡，对细胞有保护作用[31]。绿原酸植物添加剂对不同日龄动物有不同的影响，卓春柳等[32]研究发现对7 日龄的海蓝蛋鸡饮水中添加1.0 g/L的杜仲叶提取物对雏鸡血清IL-2的水平有升高的趋势，而在21 日龄添加时会显著降低血清IL-2 含量。山茱萸中的莫诺苷具有抑制促炎因子的表达，促进抗炎因子的表达，从而促进脊髓组织的抗炎和抗凋亡作用[33]。

3.5 不同含量复合植物提取物对羔羊抗氧化能力的影响

SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC 和MDA 可以在一定程度上反映机体的抗氧化能力。生物机体内进行有氧代谢时，会产生氧化自由基。这种自由基可以与多不饱和脂肪酸反应导致大量脂质氢过氧化物的产生，这些过氧化物进一步分解形成MDA 等分解产物，对机体产生损伤[34]。许多研究表明在饲料中添加植物添加剂可以提高动物机体的抗氧化能力，Wu 等[35]研究发现100、200 mg/kg 和300 mg/kg 的大豆异黄酮和黄芪多糖混合液可以显著降低哺乳母猪血清中MDA的含量，200 mg/kg 的混合液可以显著提高血清SOD的活性。王多伽[36]研究发现绿原酸可以显著提高吉戎兔血清SOD的活性。本次试验与上述试验相符，说明1.5 g/kg的复合植物提取物可以显著改善羔羊的抗氧化性能，可能是因为黄芪多糖可以幼畜的抗感染能力，增强机体免疫水平[37]。绿原酸的化学结构含有多个酚羟基，这些酚羟基结构极易与自由基产生反应，使其失去活性，起到抗氧化的作用[38]。峦娜等[39]对山茱萸环烯醚萜进行分离纯化，发现4组与马钱苷有关的化合物具有很好的抗氧化活性，说明山茱萸也具有抗氧化能力，但山茱萸抗氧化作用的机理还待进一步研究。

4 结论

在饲粮中添加适宜量的复合植物添加剂可以降低羔羊的腹泻频率。

在饲粮中添加1.5 g/kg复合植物提取物可显著增加羔羊机体的免疫能力和抗氧化能力。