乌苏里拟鲿SCoT多态性引物筛选

◎ 文/陈玉函 姜淑泓 黄金泰 李冰清 赵道全 张岚 王磊

为探索和完善乌苏里拟鲿遗传学研究中的分子标记技术，本实验对乌苏里拟鲿80条SCoT引物进行多态性及其最佳退火温度筛选，从中得出26条具有多态性且条带清晰的引物，共扩增出135条条带，其中多态性条带86条，占总条带数的63.70%，多态百分率为25%～100%，最佳退火温度为47℃～63℃。该研究结果为SCoT分子标记技术在乌苏里拟鲿相关研究中的应用提供了参考。

乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）俗称牛尾巴、招财鱼等，属鲇形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、拟鲿属（Pseudobagrus），在中国大部分江河、湖泊等水域均有分布，是一种重要的中小型经济鱼类，其肉质细嫩，无肌间刺，味道鲜美，营养价值和经济价值均较高，深受消费者和养殖户的青睐。

在鱼类分子标记的研究中，常见的分子标记有限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、随机扩增多态性DNA标记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列标记（Simple Sequence Repeats，SSR）、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）等。目前，关于乌苏里拟鲿遗传学的研究报道常用的分子标记主要有RAPD、SSR及SRAP等，以上方法在灵敏度、稳定性、操作性上有各自的优点，但也存在成本高、耗时长或重复性差等缺点。

2009年，澳大利亚学者Collard和美国学者Mackill开发了一种针对ATG起始密码子及侧翼保守性序列开发的新型目基因分子标记技术（SCoT），此分子标记具有成本低廉、多态性高、通用性强、操作简单等优点。国内外已有许多学者利用SCoT分子标记对众多物种（如：橙点若鲹、六带鲹、黑尻鲹等）进行了研究，但关于SCoT分子标记在乌苏里拟鲿中的研究目前尚未见报道。因此，本实验利用SCoT分子标记技术对80条SCoT引物进行筛选，以期为SCoT分子标记技术在乌苏里拟鲿中的应用提供理论参考。

一、材料方法

（一）实验材料

1.乌苏里拟鲿

该研究所用的12尾乌苏里拟鲿样本采自河南省水产科学研究院试验中心，每尾个体剪取尾鳍组织后放在装有无水乙醇的EP管中常温保存备用。

2.SCoT引物

所用SCoT1～SCoT80由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物长度为18bp，推荐退火温度49.6℃～63.2℃，将引物稀释至0.05μmol/L备用。供试引物序列信息见表1。所用2×Taq PCR Master Mix（含染料）、基因组DNA提取试剂盒、DL2000均购于北京某公司。

表1 SCoT引物信息

（二）DNA提取与检测

采用DNA提取试剂盒（D2100-100T）提取乌苏里拟鲿鳍条的基因组

DNA，利用NanoDropOne/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪测定DNA浓度，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

（三）SCoT-PCR反应

乌苏里拟鲿SCoT-PCR反应体系（20mL）为：10mL的2×Taq RCR Master Mix、1mL的模板DNA、1mL的引物（0.05mol/L）以及8mL的ddH2O。

PCR扩增程序为：95℃预变性4min；95℃变性40s，适宜退火温度复性50s，72℃延伸90s，共36个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

（四）退火温度的确定及多态性引物筛选

使用如上PCR体系对SCoT的80条引物进行筛选。PCR扩增实验程序同上，设置8个退火温度为47℃、48.1℃、50.3℃、53.6℃、57.7℃、61.1℃、63℃、64℃。取10μLPCR产物、以2μL Marker为参照在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液为1×TAE，电压为200V，电泳时间为25min，初步筛选出每条引物的最佳退火温度。在该温度及其前后两个温度下再次进行如上PCR扩增及电泳实验，每个梯度设置3个平行，观察凝胶成像，进而准确筛选出引物的最佳退火温度。利用上述筛选获得的条带清晰的引物及其最佳退火温度，对12尾乌苏里拟鲿基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增实验程序同上。

（五）数据处理

SCoT-PCR扩增产物按同一迁移水平下条带的有无分别赋值，有条带记为1，无条带记为0，人工读取和统计条带。

二、结果分析

（一）SCoT引物及其退火温度的筛选

对SCoT引物退火温度筛选的结果表明，对于同一模板DNA，在不同的退火温度下，引物的扩增效果在条带明亮程度及清晰度上存在较大差异。以SCoT-23（见图1）为例，当退火温度为53.3℃时，扩增条带完整且清晰明亮，当退火温度为大于或小于53.3℃时，扩增条带不完整且模糊；根据最佳退火温度的筛选，从80条引物中筛选出条带清晰的引物35条，最佳退火温度见表2。

表2 35条SCoT引物及其退火温度

图1 SCoT-23扩增的PCR产物

（二）多态性引物的筛选

利用上述扩增出的条带清晰的35条SCoT引物及其最佳退火温度，对12尾乌苏里拟鲿基因组DNA进行PCR扩增，最终筛选出26条条带清晰、具有多态性的SCoT引物。如表3所示，26条引物共扩增出135个条带，范围为3条～9条，其中多态性条带86个，平均每条引物扩增出3.31条多态性片段，范围为1条～7条，多态性比率为64.28%。多态性最高的引物为SCoT-18、SCoT-25、SCoT-61、SCoT-72，多态百分率均为100%；多态性最低的引物为SCoT-23，多态百分率为25%。部分引物对乌苏里拟鲿扩增结果如图2所示。

图2 SCoT-29扩增的PCR产物

表3 26条SCoT引物扩增结果

三、讨论

SCoT分子标记是一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术，扩增产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，其操作简单，易于各物种SCoT-PCR反应体系的建立，且成本相对较低，在生物多样性分析、遗传图谱构建和重要性状标记等方面得到广泛应用。不同的实验材料与反应条件下的退火温度各不相同，因此有必要针对不同的物种筛选适宜的SCoT退火温度。本实验从80条引物中筛选出26条条带完整、清晰且多态性较高的引物，退火温度分布在47℃～63℃，在26条适用引物中，退火温度为50.3℃的有13条，占适用引物的50%。

有学者在利用SCoT标记对花生属遗传多样性分析中，筛选出19条多态性引物，多态性比率为31.80%；有研究表明，对欧洲舌齿鲈与斑点舌齿鲈两个相近物种遗传关系分析时所利用的11条SCoT引物的多态性比率为39%；另有学者对橙点若鲹、六带鲹、黑尻鲹相互间的遗传多样性分析时所利用的12条SCoT引物的多态性比率为39%、35%、53%。该实验筛选出能在乌苏里拟鲿中扩增的26条多态性引物，其多态性比率为64.28%，明显高于上述物种，这可能是因为乌苏里拟鲿的亲本来自自然水域，保留了较高的多态性。该实验首次将SCoT分子标记技术应用于乌苏里拟鲿，填补了乌苏里拟鲿SCoT分子标记方面的空缺，为SCoT分子标记在乌苏里拟鲿中的应用提供了参考。