噬菌体防治副溶血弧菌感染研究进展

李文馨，许 华，黎睿君，董 宣，黄 倢

（1.大连海洋大学，辽宁大连 116023；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业农村部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，山东青岛 266071）

随着水产养殖业的快速发展，在养殖产量提高的同时，病害频发和抗生素滥用等相关问题也逐渐暴露出来，制约了水产养殖业的绿色高质量发展。细菌性疾病是水产养殖业中流行较为广泛且危害严重的疾病。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是常见致病菌之一，广泛分布于水生环境中，给水产养殖业造成了损失，也是引发食源性疾病的重要致病菌，给人类健康带来威胁。副溶血弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐致病菌，广泛存在于海水及鱼、虾、贝类等水产养殖动物中，并引起水生动物感染发病，如可引起对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）[1]、凡纳对虾“玻璃苗”[2-4]等。

目前，无论在水产养殖中还是临床医学上，抗生素已成为防治副溶血弧菌相关疾病的主要手段之一，而抗生素的误用和滥用导致细菌耐药性增强的问题日趋严重[5]。张宝存等[6]从患病凡纳对虾中分离到一株高毒力且对多种抗生素都耐药的副溶血弧菌，后被证明是AHPND 的致病菌[7]。Jiang等[8]从海产品中分离出90 株副溶血弧菌，发现大多数分离株对氨苄青霉素（86/90）和头孢唑啉（75/90）表现出耐药性，其中40 株对至少3 种抗生素具有耐药性。据中国疾病预防控制中心[9]报道，2016—2020 年我国临床分离出的副溶血弧菌对头孢唑啉和氨苄青霉素的耐药率较高，分别为94%和37%。为遏制抗生素滥用问题，农业农村部实施了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017—2020 年）》，通过“禁抗、减抗、限抗”的努力，动物用药中抗生素的科学使用已获得了初步成效，提前2 年完成了动物用抗菌药使用“零增长”目标[10]。2022 年初，农业农村部又颁布了《2022 年动物源细菌耐药性监测计划》，以进一步遏制抗生素滥用问题[11]。

近年来，噬菌体（bacteriophage）作为一种治疗细菌性疾病的新型抗生素替代品被广泛关注。本文就噬菌体在副溶血弧菌感染防治方面的应用和噬菌体生物工程研究现状，以及副溶血弧菌噬菌体现存问题及对策进行概述，旨在表明噬菌体制剂在治疗细菌性疾病方面具有广阔的应用前景，对在当前形势下寻找有效、绿色、健康发展的水生动物细菌性疾病新型治疗方式具有重要意义。

1 噬菌体优势及其在副溶血弧菌感染防治方面的研究

1.1 噬菌体优势

噬菌体是一种能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，可以特异性侵染宿主菌，引起宿主菌死亡[12]。噬菌体治疗相对于抗生素治疗具有其潜在的优势：首先，噬菌体只针对相应的病原菌，具有高度的宿主特异性，主要通过受体结合蛋白（RBPs）与细菌表面受体特异性结合来完成吸附这一过程，随后通过抑制宿主细胞细胞壁的合成或通过溶解酶破坏宿主细胞壁来靶向杀灭特定的菌株，这种特异性大大降低了其对环境和动物体中其他菌群的威胁，且治疗效果不受细菌耐药性影响[12-14]。从噬菌体特性来看，它可以随宿主菌的增殖而指数增殖，并在细菌感染的整个过程发挥作用，这是一个重要优势[14-16]。其次，噬菌体具有宿主菌依赖性，只在细菌感染部位发生作用，裂解目标菌后会被降解或快速代谢掉[17]。最后，噬菌体来源非常丰富，易从宿主细菌栖息环境中发现并分离，常见于污水、土壤、废液等容易滋生细菌的环境中[18]。从应用方面来看，噬菌体制剂既可以泼洒，也可制成饲料，易于给药。

1.2 副溶血弧菌噬菌体应用

目前已有大量副溶血弧菌噬菌体被分离并报道。Guo 等[19]分离出一株新的ssDNA 噬菌体vB_VpaM_PG19，为致病性副溶血弧菌的潜在生物防治剂提供候选物。Tian 等[20]分离出一株副溶血弧菌特异性噬菌体vB_VpS_PG28，通过基因组注释分析未发现任何与抗性或毒力因子相关的基因。Matamp 等[21]分离出一株副溶血弧菌噬菌体φVP-1，其可感染多重耐药副溶血弧菌和溶藻弧菌菌株，而且具有进行基因组工程改造的可能性。

1.2.1 利用噬菌体检测 噬菌体对宿主的敏感性和特异性在检测方面具有重要的应用前景。使用噬菌体检测副溶血弧菌需提前筛选出裂解谱不同、裂解力强且稳定的噬菌体株，并基于还原型辅酶I（NADH）作为指示剂，结合噬菌体的特异性和NADH的普遍性来实现对副溶血弧菌的定量检测。该方法灵敏度高且用时短，操作简便适用于现代快速检测。但由于噬菌体的特异性识别不能感染所有的副溶血弧菌，因此应用受到极大限制，但可以通过噬菌体鸡尾酒疗法进行优化，从而有效克服这一缺点[22-23]。

1.2.2 利用噬菌体防治副溶血弧菌感染

1.2.2.1 软体动物防治 副溶血弧菌在我国沿海水域、海产品中的检出率较高，可引起多种养殖贝类大量死亡，是养殖贝类的主要病原菌之一，某些致病性副溶血弧菌也能污染贝类产品从而对人类健康构成风险[24-25]。而使用噬菌体来处理副溶血弧菌污染过的软体动物，可有效控制养殖动物体内及养殖环境中副溶血弧菌数量[26]。Jun 等[27-28]发现一株宽裂解谱噬菌体pVp-1 对27 株具有多重耐药性的副溶血弧菌中的20 株具有良好的溶菌作用，并在此基础上进行了生物防治试验，结果采用药浴或表面给药均可使牡蛎感染得到有效控制。有研究人员考察了噬菌体制剂不同时间内对牡蛎的保护作用，分别于感染后48 h 和72 h 处理人工污染的牡蛎，结果显示牡蛎表面的副溶血弧菌灭活率分别为90%和99%[29]。

1.2.2.2 甲壳类动物防治 副溶血弧菌可引起对虾多种疾病。目前已成功分离出诸多不同的副溶血弧菌噬菌体，并将其应用于生物防治。Dubey 等[30]分离出一株丝状副溶血弧菌特异性噬菌体V5，并测试噬菌体V5 控制对虾副溶血弧菌感染的效力，发现应用噬菌体1 h 内细菌数量减少了78.1%。Lomelí-Ortega 等[31]测试由vB_Vc_SrVc2 和vB_Vc_SrVc9 组成的噬菌体混合物对凡纳对虾仔虾的保护作用，结果发现：两种噬菌体在体内和体外条件下均具有抑制致病性弧菌生长的能力，噬菌体鸡尾酒疗法能够选择性有效减少弧菌数量（溶藻弧菌和副溶血弧菌）；同时组织病理学检查发现，经噬菌体处理的对虾，其肝胰腺损伤减弱。Jun 等[32]使用噬菌体pVp-1 对22 个从不同区域分离出的致AHPND 副溶血弧菌菌株（VpAHPND，5 株亚洲型和17 株墨西哥型）进行了感染试验，发现该噬菌体能够感染其中20 株菌株，并对3 株已知的高致病性菌株（13-028/A3 来自越南，13-511/A1 和13-306D/4 来自墨西哥）表现出显著的溶菌活性，表明噬菌体pVp-1在防控AHPND方面具有巨大潜力。2018 年为了评估噬菌体对AHPND 的有效性，Jun等[33]利用凡纳对虾进行了一系列生物测定，并对其死亡率及组织学变化进行了监测，发现使用口服方式多次投喂pVp-1 噬菌体进行预防和治疗可以使对虾在致命菌株攻击中存活，且组织损伤明显减弱。2022 年，González-Gómez 等[34]从墨西哥锡那罗亚州的河口水中分离出两株噬菌体（vB_VpaP_AL-1和vB_VpaS_AL-2），发现其可以感染墨西哥分离的VpAHPND，通过基因组测序没有发现与毒力、溶原性或抗生素抗性相关基因。因此，噬菌体作为特异性病原体的防治手段，在防治甲壳类动物副溶血弧菌感染方面具有巨大潜力。Li 等[35]还分离到对坎贝氏弧菌（V.campbellii）具有强烈裂解能力的弧菌噬菌体vB_VcaS_HC。由于坎贝氏弧菌可与副溶血弧菌发生质粒转移而获得致AHPND 的毒力，因此使用坎贝氏弧菌噬菌体来杀灭坎贝氏弧菌，可以降解由于致病性副溶血弧菌与其他弧菌发生结合转移对甲壳动物造成的伤害[36-37]。

1.2.2.3 鱼类防治 副溶血弧菌同样可引起鱼类发病，在对水产养殖业造成巨大损失的同时，也同样导致食品安全风险。Lal 等[38]分离出一株可以抑制副溶血弧菌的噬菌体VpKK5，可以裂解对鱼类致病的副溶血弧菌菌株。研究发现：噬菌体即使在生鱼片等复杂的食物基质中也能感染和破坏病原体，显著降低生鱼片中的副溶血弧菌含量；噬菌体浓度越高，杀菌效果越明显，结合低温处理，对样品中副溶血弧菌的控制效果更好。因此，噬菌体具有防治副溶血弧菌感染和作为生物杀菌剂的应用潜力[39-40]。

1.3 噬菌体生物工程改造

随着基因工程技术的不断发展，通过对现有噬菌体进行人工修饰，扩大噬菌体宿主范围，弥补噬菌体治疗中的一些缺陷，从而解决当前噬菌体在防治副溶血弧菌感染中的一些问题。

1.3.1 改变噬菌体宿主范围 Hoshiga 等[41]使用CRISPR/Cas9 系统对T2 噬菌体基因组进行编辑，将T2 噬菌体的长尾纤维和短尾纤维的末端替换为PP01 噬菌体的对应基因，发现成功改造后的噬菌体对大肠杆菌O157:H7 显示出与PP01 相当的吸附能力，人工扩大了大肠杆菌O157:H7 特异性噬菌体范围。李艳秀等[42]将两株T4 噬菌体的宿主决定区基因片段进行了同源重组，使获得的嵌合噬菌体具备相对较宽的宿主谱，且可以稳定遗传，从而为快速构建针对特定病原菌的噬菌体奠定了基础。

1.3.2 改变噬菌体对特定宿主菌的裂解能力 内溶素（endolysin）是来自噬菌体的肽聚糖水解酶。利用基因工程克隆和重组内溶素可有助于解决使用噬菌体控制副溶血弧菌的不足。Xia 等[43]分离了一株副溶血弧菌特异性噬菌体F23s1，随后将其内溶素基因克隆并在大肠杆菌中成功表达，研究发现内溶素LysF23s1 对耐药的副溶血弧菌（23/23）和沙门氏菌（12/13）具有裂解活性，并显示出比完整噬菌体（13/37）更宽的裂解谱。Ning 等[44]基于来自副溶血弧菌噬菌体的内溶素Lysqdvp001 设计了3 种阳离子肽修饰内溶素（Lysqdvp001-5aa、Lysqdvp001-10aa 和Lysqdvp001-15aa），发现这些重组内溶素显示出与Lysqdvp001 相当的肽聚糖水解活性，能够从外部裂解细菌；在使用最低杀菌浓度时，Lysqdvp001-15aa 根除了约50%的副溶血弧菌生物膜，并抑制了90%以上的细菌生物膜形成。

2 副溶血弧菌噬菌体现存问题及对策

噬菌体特异性普遍较强，宿主范围一般较窄。而海洋动物的生存环境复杂，细菌病的暴发往往不是单种细菌引起的，因此单一的噬菌体很难起到很好的防治效果。利用噬菌体来控制水产养殖中的弧菌虽然是有利的，但有报道[45]认为，在单一噬菌体治疗弧菌病的情况下，弧菌能产生一定的抗性进而降低防治效果，而使用噬菌体混合物（V1G、V1P1 和V1P2）明显延缓了细菌抗性的演化，使噬菌体可以持续侵染细菌，这说明在防治疾病过程中，多个噬菌体的联合使用是控制弧菌病的重要策略。Mateus 等[46]评估了多株副溶血弧菌噬菌体混合物（VP-1、VP-2 和VP-3）在水产养殖中控制弧菌的效果，结果发现与单独使用VP-1、VP-2噬菌体相比，混合使用2 株或3 株噬菌体防治效果和效率均有不同程度的提高，且延迟了细菌抗性发展。因此可以考虑循环使用不同的裂解性噬菌体来避免细菌抗性的产生，并且使用噬菌体鸡尾酒疗法，将不同裂解谱的噬菌体结合起来，对受感染的动物进行治疗，从而获得更为全面的治疗效果[47]。噬菌体鸡尾酒疗法还可与其他疗法联合使用，例如“噬菌体-抗生素联合疗法”和“噬菌体-益生菌联合疗法”。2021 年Engeman 等[48]使用5 株铜绿假单胞菌噬菌体与4 种抗生素联合治疗，发现在噬菌体存在的情况下，对这些抗生素敏感的铜绿假单胞菌菌株数分别有不同程度的增加。2014 年，Surekhamol 等[49]评估了噬菌体对虾生产系统中有益微生物群的侵染情况，结果发现养殖系统中使用的硝化细菌和蜡状芽孢杆菌、节杆菌等益生菌对添加的病原菌噬菌体均不敏感，表明在对虾生产系统中噬菌体与益生菌疗法相结合有一定的可行性。

值得注意的是，噬菌体的安全风险仍需进一步评估。目前已发现某些噬菌体在致病菌毒力或抗生素抗性演化中发挥重要作用[50]，如霍乱弧菌、链球菌等都存在噬菌体介导的毒力基因转移[51-52]。副溶血弧菌O3:K6 血清型含有质粒pO3K6，其被证明是来自丝状噬菌体f237基因组，其编码的ORF8 可能与副溶血弧菌所致的食源性腹泻大流行相关[53]。由于副溶血弧菌在海水养殖环境中普遍存在，早期对副溶血弧菌致AHPND 的机制研究上，曾怀疑副溶血弧菌获得的致病性是由溶源性噬菌体带来的[54]。但经过对多株VpAHPND的溶源性噬菌体分析，未观察到溶源性噬菌体与副溶血弧菌的致病性存在某种关联，否定了这一猜测[55]。最近的研究[7，37，56-58]证明，VpAHPND的毒力质粒是通过接合转移或者自然转化在弧菌间传递。这些研究可消除人们对应用噬菌体可能会增强AHPND 相关副溶血弧菌致病性的担忧。

3 展望

世界卫生组织（WHO）在2015年通过了《Global Action Plan on Antimicrobial Resistance》（https://www.who.int/publications/i/item/9789241509763），世界动物卫生组织（WOAH）全球大会也在同年5 月通过了《Resolution No.26: Combating Antimicrobial Resistance and Promoting the Prudent Use of Antimicrobial Agents in Animals》，并在《水生动物卫生法典》对水生动物中抗生素使用问题做了严格规定，以限制抗生素滥用。《中华人民共和国生物安全法》也将微生物耐药作为一个重要的生物安全问题考虑。噬菌体是破解抗生素滥用所导致的微生物耐药难题的新型生物制剂，其宿主特异性和对特定病原菌的高效裂解能力赋予了这一技术领域广阔的应用前景。但是，在噬菌体走向实际应用市场的过程中，除了在科学技术方面需要取得突破以外，还需要满足批量化生产的条件和兽药生物制剂相关法律的规定。按照《兽药管理条例》等法规的相关规定，须进行临床前研究审核和临床试验。近年来，我国在动物药剂行业已有企业投入了噬菌体产品的商业开发[59]。目前，噬菌体在水产养殖领域的研究还处在初级阶段，深入研究噬菌体的结构与功能，揭示噬菌体与宿主之间相互作用关系，是推动噬菌体应用于生产实践的重要基础。优化噬菌体的鸡尾酒疗法、噬菌体基因编辑等，将成为噬菌体治疗研究领域的重要方向。相信随着国内外噬菌体领域研究的不断深入，噬菌体将逐步成为水产养殖绿色发展和生物安保的重要工具。