流式浆细胞及骨髓涂片检测在多发性骨髓瘤中的诊断价值及其与临床分期的相关性

孟亚红 范小红 化范例 孙丽华

多发性骨髓瘤是一种发生在患者骨髓的恶性肿瘤，是骨髓的浆细胞恶性克隆性增殖，进而使得肿瘤细胞在髓内增殖扩散，所致的血液系统的恶性肿瘤疾病［1］。目前，对于多发性骨髓瘤的诊断以骨髓穿刺活检为主要的检查方法，是通过专用穿刺针抽取少量的骨髓液和取出一小块完整骨髓组织样本进行分析，能够较为准确的反映骨髓瘤细胞的真实分布定位情况，从而做出诊断结果，也是目前活动性多发性骨髓瘤的诊断标准之一［2］。近年来随着诊断技术的发展，分子生物学检测方法应用不断推广，流式细胞术检测以其灵敏、快速、准确的检测优势，逐步在多发性骨髓瘤诊断中发挥较大的作用［3］。本文探讨流式细胞术、骨髓涂片检查在多发性骨髓瘤诊断及临床分期中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月至2018年12月本院疑似多发性骨髓瘤患者120例。其中男64例，女56例；年龄32～78（52.89±10.23）岁。高血压29例、高血脂18例、高血糖17例。纳入标准：①M蛋白血症；②存在以下表现之一：贫血、骨痛、肾功能不全、感染、出血、神经症状、高钙血症等症状；③患者精神状态正常，能够配合。排除标准：①其他血液系统恶性疾病病史；②不能耐受骨髓穿刺取样；③临床资料不全；④样本被污染的患者。本研究经医院伦理学委员会批准。患者均签署知情同意书。

1.2 检测方法 所有患者均采用BMT-B-3 2.7X70型骨髓活检针（上海斯埃医械塑料制品有限公司）在髂前或髂后上棘进行一步法抽吸取出骨髓液样本后套上接柱，继续进针取出骨髓组织块。（1）流式浆细胞及其轻链限制性表达检测：将骨髓标本加入到含肝素的抗凝管中，用PBS缓冲液洗涤，调整细胞浓度，标记流式管，管内分别加入下列抗体组合：IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD/IgG1-PC5/CD45-PC7，CD38-FITC/CD138-PE/CD19-ECD/CD56-PC5/CD45-PC7，CD71-FITC/-/CD41-ECD/7AAD/CD45-PC7；室温避光孵育20 min，然后加入溶血素Optilyse C 500μL震荡混匀，室温避光放置10 min；2 mL流式缓冲液洗涤、600μL上机液重悬，待检测。胞内轻链检测按如下抗体组合，CyKappa-FITC/CD138-PE/CD19-ECD/CD38-PC5/CD45-PC7，CyLambda-FITC/CD138-PE/CD19-ECD/CD38-PC5/CD45-PC7，CyIgG-FITC/CD138-PE/CD20-ECD/CD38-PC5/CD45-PC7，首先按细胞表面标记染色，将细胞表面标记染色完成，离心后去上清液，留细胞沉淀，然后开始胞内抗体的染色。破膜剂50μL孵育细胞沉淀5 min，PBS洗涤后加入Kappa/lammda轻链抗体，避光孵育30 min。2 mL流式缓冲液洗涤、600μL上机液重悬，待检测。BeckmanCoulter FC500 MCL五色流式细胞仪上机检测样本，获取30,000个细胞，FCS Express软件分析数据。浆细胞以CD38或CD138设门，当胞内к:λ＞3∶1或＜1∶3考虑为轻链限制性表达。（1）骨髓涂片检测：取一份骨髓涂片，自然干燥后，进行瑞氏-吉姆沙染色。染色约10～15 min，水洗，晾干，镜检。在低倍显微镜下观察骨髓增生情况，并在高倍显微镜下对骨髓有核细胞数量、分布、形态及造血组织比例，并分类计数各阶段的有核细胞百分率。多发性骨髓瘤诊断判断标准为：视野中骨髓浆细胞≥10%，并伴有不同程度的形态异常。（3）骨髓活检：取一份骨髓组织加入固定液固定1 h后用无水乙醇进行脱水，以塑料包埋液包埋、切片、制片，厚度2～5 μm，进行胶原蛋白三色染色。用10×10规格网形测微器计数法，于400倍显微镜下，观察骨髓造血细胞、脂肪细胞、骨小梁的面积，判断其增生度，同时判断Gomori染色积分。多发性骨髓瘤诊断阳性判断标准为：骨髓内有10%或更多克隆性浆细胞。

1.3 观察指标 依据中国多发性骨髓瘤诊治指南（2015年修订），统计流式细胞检测法、骨髓涂片检测法的诊断准确率，并比较两种检测结果的敏感度、特异度、准确度、假阳性率、假阴性率等。将患者按临床分期的不同进行分组，比较两种检测方法对不同分期患者的诊断准确率。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较用t检验，计数资料以［n（%）］表示，组间比较用χ2检验，多种诊断结果间的一致性分析采用Kappa一致性检验，Kappa值＞0.75时表示方法间一致性良好，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法与结果比较 120例患者经骨髓活检确诊为多发性骨髓瘤阳性患者113例，阴性患者7例。骨髓涂片检测阳性率为89.17%，流式细胞术阳性率为75.83%，经Kappa一致性检验分析，骨髓涂片检测与活检组织结果有良好的一致性，而流式细胞术检查与活检组织结果一致性稍差，见表1～2。

表1 骨髓涂片检测与活检结果一致性比较

表2 流式细胞术检测与组织活检结果一致性比较

2.2 不同临床分期检测结果比较 经骨髓活检显示I期患者41例，II期患者45例，III期患者27例，在不同临床分期比较中，I期患者中流式浆细胞检测阳性率高于骨髓涂片检测（P＜0.05），见表3。

表3 不同临床分期检测结果比较［n（%）］

3 讨论

多发性骨髓瘤是血液系统常见的恶性肿瘤。近年来其发病率逐年升高，随着发病率的升高，临床上对其关注度也在不断提升［4］。对于大多数多发性骨髓瘤患者而言，患者的症状并无明显的特异性，且处于早期时症状也较为轻微，常未引起患者本人的重视，因而出现大量漏诊、误诊的出现。这也给多发性骨髓瘤的诊断和治疗带来较大的阻碍，不利于患者尽早的开展相应的诊疗措施［5］。目前，对于多发性骨髓瘤的诊断以骨髓组织病理学活检为主要标准之一，通过骨髓的穿刺取样，取出一小块完整骨髓组织样本进行分析，对骨髓细胞的成分、原始细胞分布状况进行观察分析，能够较为准确的反映骨髓瘤细胞的真实分布定位情况，从而做出诊断结果。在此基础上结合患者的临床症状表现、影像学检查等作出诊断。

在实验室检查中，骨髓涂片细胞形态学检查也是多发性骨髓瘤诊断的重要方法，该方法具有经济、直观、操作简单的特点，是目前多发性骨髓瘤最基础、广泛的检查方法，在多发性骨髓瘤的诊断、疗效评估中发挥一定的作用［6］。但是，骨髓涂片检查也存在着一定的缺陷，主要是由于骨髓瘤细胞髓内浸润和增殖范围程度不同，且患者的脂质丰富易黏附聚集，给检查结果带来一定的偏差，且在患者多次骨髓穿刺检测时，结果变异大，导致诊断结果可信度降低［7］。流式细胞仪检测是通过对骨髓瘤细胞异常免疫表型的特异性识别，能够将微量的瘤细胞从众多骨髓细胞中圈出，能够快速识别异常增生的骨髓浆细胞。具有灵敏、快速、准确、客观的技术优势，在临床各型基本的诊断中均具有良好的应用［8］。在本研究中，经骨髓活检显示I期患者41例，II期患者45例，III期患者27例，在不同临床分期比较中，I期患者中流式浆细胞检测阳性率高于骨髓涂片检测，而在II期、III期中两种检测方法差异无统计学意义，这是因流式浆细胞检测的敏感度更高，对于症状较轻的I期患者也能够检测确诊。

综上所述，流式浆细胞及骨髓涂片检测均能用于多发性骨髓瘤患者的诊断检查，但相比于骨髓涂片检查，流式浆细胞检测的准确率更高，对于早期患者的诊断敏感度更高，值得临床推荐。