Chemerin与子宫内膜异位症相关性分析

俞桢

子宫内膜异位症（Endometriosis，EM）是指子宫内膜腺体或间质移植在子宫黏膜以外的其他部位，且在移植位置生长，从而引起的疾病。该病的发病机制尚未清楚，研究发现，EM患者腹腔液和血清中炎症因子水平升高［1-4］，炎症因子刺激T淋巴细胞和单核细胞分泌相关趋化因子，从而引发异位子宫内膜转移和定植，揭示子宫内膜异位诱发非特异性免疫引起的慢性炎症反应［5-7］。由于腹腔壁切口内异位病灶多发生于腹壁皮下脂肪组织中，因此子宫内膜异位的发生可能与脂肪组织相关。Chemerin是由脂肪细胞分泌的一种具有趋化性的脂肪因子，对白细胞具有趋化作用并具有双向调节炎症反应的作用［8-9］。本文探讨Chemerin蛋白的表达水平与子宫内膜异位症发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年1月至2021年9月上虞人民医院EM患者15例（EM组）和健康女性5例（对照组）。EM患者均因子宫内膜异位接受腹腔镜手术，各项临床资料完整。健康者为因不孕等原因行宫腔镜检查确定无EM。本研究经上虞人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。纳入标准：①月经周期正常，且处于生育年龄；②无内分泌疾病；③参与本次研究前6个月内无激素类药物治疗史和宫内节育器放置；④临床资料完整。排除标准：①合并自身免疫系统疾病、代谢性疾病者；②合并生殖道炎症疾病者。

1.2 方法 （1）仪器与试剂：血清与核酸保存剂、RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒购自TaKaRa公司；SYBR Green Super Mix购 自Tsingke公司；Anti-Chemerin antibody（ab203040）、Anti-CMKLR1 antibody（ab203384）、Chemerin ELISA试剂盒（ab155430）购自Abcam公司；S-P免疫组织化学法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；NanoDrop2000核酸分析仪购自Thermo Fisher Scientific；CFX96荧光定量PCR仪购自Bio-rad；RT-6100全自动酶标仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。引物合成及测序服务由上海生工生物工程有限公司提供服务，见表1。（2）ELISA检测血清中Chemerin表达水平：采集患者空腹静脉血5 mL，3,000 rpm离心分离血清，采用ELISA法检测血清中Chemerin表达水平，RT-6100全自动酶标仪测定血清Chemerin水平。（3）RT-qPCR技术检测子宫内膜中mRNA的表达：称取0.1 g在位内膜、异位内膜组织，液氮下研磨，采用RNA抽提试剂盒提取RNA，反转录合成CMKLR1和Chemerin cDNA。以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测，反应步骤为：94℃预变性2 min→（94℃ 15 s→58℃ 20 s→72℃ 30 s）×40个循环→72℃延伸5 min，在58℃时收集信号。以β肌动蛋白（β-actin）作为内参，采用2-ΔΔCT法进行分析CMKLR1和Chemerin mRNA表达情况。（3）免疫组化检测：所有内膜组织经脱水、透明、石蜡包埋后制成厚度4 μm的石蜡切片。常规免疫组织化学法检测在位内膜和异位内膜组织中Chemerin和CMKLR1表达情况，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，抗体稀释比例均为1∶200，分别以磷酸盐缓冲液和已知抗体阳性样本作为阴性和阳性对照，二氨基联苯胺显色。Chemerin和CMKLR1均主要表达于细胞质中，以该部位出现淡黄色至棕褐色为阳性。所有免疫组化切片均由2位病理医师评定，结果不一致经共同商议后确定。

表1 引物序列

1.3 统计学方法 采用 SPSS 25.0统计软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素ANOVA检验或t检验；计数资料为n（%）表示，组间比较采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 见表1。

表1 两组一般资料比较（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）

项目 EM组（n=15） 对照组（n=5） t值 P值年龄（岁） 32.17±5.26 31.54±5.38 0.231 0.820体重（kg） 58.27±6.53 58.42±6.28 0.045 0.965体质量指数（kg/m2） 22.09±2.87 22.37±2.96 0.188 0.853

2.2 血清Chemerin水平比较 EM患者血清Chemerin水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。Pearson相关分析发现，血清Chemerin水平与EM患者分期存在正相关性（r=0.638，P＜0.05）。

图1 EM组和健康对照组血清Chemerin水平比较

2.3 内膜组织中Chemerin和CMKLR1 mRNA水平比较 EM患者在位内膜和异位内膜组织中Chemerin mRNA相对表达水平均高于对照组，而EM患者异位内膜组织中Chemerin mRNA相对表达水平高于在位内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。EM患者在位内膜、异位内膜与对照组内膜组织中CMKLR1 mRNA相对表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 EM组在位和异位内膜与健康对照组内膜Chemerin mRNA水平比较

图3 EM组在位和异位内膜与健康对照组内膜CMKLR1 mRNA水平比较

2.4 内膜组织中CMKLR1蛋白免疫组织化学结果比较 与对照组内膜比较，EM组在位内膜CMKLR1棕黄色或深棕色细胞未见显著增多，异位内膜组棕黄色或深棕色细胞增多（见图4）。异位内膜组织中CMKLR1表达强度和阳性率高于对照组和在位内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

图4 EM组在位和异位内膜与对照组内膜CMKLR1表达比较（免疫组织化学法×200）

表2 内膜组织中CMKLR1表达强度比较［n（%）］

3 讨论

子宫内膜异位症是妇科常见良性疾病，患者子宫腔外存在具有相同功能的子宫内膜，异位病灶造成盆腔解剖结构异常及盆腹腔微环境的改变，表现为慢性盆腔痛、不孕不育、痛经等临床症状［10］。

目前关于子宫内膜异位的病因有多种解释机制，其中细胞因子在内异症发生过程中具有重要作用。细胞因子能够触发内膜细胞对腹膜间皮细胞层的黏附和侵袭，促进血管形成，促进异位内膜生长［11-12］。在疾病早期，促炎性细胞因子能够促进异位灶内膜间质细胞与单核巨噬细胞高水平表达IL-27，IL-27直接抑制总Th17细胞分化，促进IL-10+ Th17细胞分化；另一方面通过调节单核巨噬细胞呈M2表型，进而间接抑制Th17细胞分化，共同介导免疫耐受环境的偏移［13］。嘌呤受体P2X3可能参与内异症的疼痛信号传导，与内异症疼痛的发生机制相关［14］。小RNAmiR-15b，miR-17-5p和miR-222可能通过调控VEGF和TSP-1等基因的表达，调控生长定植所需要的血管，促进内异症的发病［15-16］。

本研究结果显示，与对照组相比，EM组Chemerin的表达量无论从mRNA水平还是蛋白水平均有提高。表明Chemerin的表达量与子宫内膜异位存在正相关。这可能与Chemerin参与炎症反应有关。与对照组相比，在位内膜组和异位内膜组CMKLR1的表达量基本一致，推测CMKLR1与子宫内膜异位症相关性不大。李雨等［17］研究发现，EM患者内膜组织中Chemerin表达水平高于健康女性内膜组织，提示Chemerin在EM发生过程中有一定作用，与本研究结果一致。