不同产地铁皮石斛茎中内生真菌群落结构与农艺性状差异相关性分析

刘朝波，闻伟锷，李肇高，罗婷婷，徐德林，钱 刚*，何芋岐，李 林*

不同产地铁皮石斛茎中内生真菌群落结构与农艺性状差异相关性分析

刘朝波1，闻伟锷1，李肇高1，罗婷婷1，徐德林1，钱 刚1*，何芋岐2，李 林1*

1. 遵义医科大学 基础医学院细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099 2. 遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563099

对不同产地铁皮石斛茎中的内生真菌群落与农艺性状进行分析，为内生真菌与铁皮石斛差异农艺性状形成的相关性研究提供基础。对采自安徽霍山（AHHS）、贵州独山（GZDS）、云南孟连（YNML）的112份铁皮石斛进行农艺性状测量，ITS测序分析内生真菌群落结构，R语言分析不同产地内生真菌丰度与宿主农艺性状的相关性。差异性分析发现3个产地的铁皮石斛在株高、茎长、茎粗均具有显著性差异（＜0.05）。内生真菌ITS检测共获得923条特征序列，可注释到3个门、138个属，产地间的铁皮石斛内生真菌在属水平上存在差异，其中AHHS的真菌群落多样性与其他产地具有显著性差异。相关分析表明，内生真菌与宿主的株高、茎长、茎粗呈显著负相关（＜0.05）。不同产地铁皮石斛茎的差异农艺性状形成与共有内生真菌的丰度的改变密切相关。

铁皮石斛；内生真菌；ITS测序；多样性分析；农艺性状；相关性分析

铁皮石斛Kimura et Migo是重要的兰科石斛属药用植物，具有养胃生津、滋阴清热的功效[1]。现代药理学研究表明，铁皮石斛具有抗氧化、抗癌、降血糖等多种药理作用，受到市场广泛关注[2]。由于自然环境下繁殖率较低，加上民间过度采挖，铁皮石斛野生资源已近枯竭，利用人工种植方式生产成为当前解决铁皮石斛供需矛盾的重要方式[3-4]。受种植方式、光照、微生物等因素的影响，不同产地人工种植铁皮石斛在有效药用成分含量、农艺性状、生物量等方面差异较大[5]。

已有研究表明，内生真菌是影响植物生长发育、次生代谢产物积累的重要生物因子，与植物的根系发育、植株形态建成等具有密切关系[6-7]。Waqas等[8]从大田种植黄瓜根中分离得到2株能分泌赤霉素（gibberellins）和吲哚乙酸（indoleacetic acid）的内生真菌（LWL2、sp. LWL3），与黄瓜植株共培养后发现内生真菌处理组的植株茎长显著高于未处理组。Qin等[9]将植物内生真菌与植物共培养，发现在提供有机氮源的条件下，多数内生真菌能将有机氮转化为无机氮，从而促进植物生长，提高植物株高。任颖[10]发现内生真菌定殖后可增加黄芪叶片数、株高、地下干质量，有利于黄芪抗旱能力提高。因此，内生真菌与植物的农艺性状改变具有密切的关系，同时在以株高、茎长等农艺性状为产量指标的药用植物研究中具有重要的意义。

对玄参[11]、杜仲[12]等多种药用植物研究发现，内生真菌广泛的存在于药用植物各组织器官中，且同种植物不同产地的内生真菌的种群结构组成、相对丰度及优势类群均存在差异。内生真菌的种群结构组成与宿主对不同环境的适应等密切相关[13]，其核心菌群、丰度变化也被证实与不同产地间药用植物次生代谢产物含量差异积累、道地性形成等密切相关[14]。但这些真菌的群落结构、丰度变化与相关农艺性状的变化的关系鲜有报道。

目前所研究的内生真菌主要为可培养内生真菌，但是宿主中可分离培养的内生真菌数量极少，导致多数内生真菌功能未被发掘。然而高通量测序技术具有准确、高效等优点，不依赖于传统培养法，成为植物内生真菌分析重要技术手段[15-16]。本研究以安徽霍山（AHHS）、贵州独山（GZDS）、云南孟连（YNML）产地人工种植铁皮石斛为材料，通过ITS测序对3个产地铁皮石斛茎中内生真菌生物多样性进行分析，并对不同产地铁皮石斛之间差异内生真菌与差异农艺性状进行相关性分析，筛选影响铁皮石斛生物产量的内生真菌，为铁皮石斛高效生产等提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

本研究从AHHS、GZDS、YNML 3个铁皮石斛产地共采集112丛人工种植的铁皮石斛进行农艺性状分析，进一步从每个产地中分别选择9个有典型特征的样本的2年生新鲜茎条经表面消毒后用于铁皮石斛内生真菌的ITS测序，所有材料均由遵义医科大学细胞生物学教研室钱刚教授鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛Kimura et Migo。

1.2 试剂与仪器

用E.Z.N.A.®Soil DNA试剂盒（批号D5625-02，美国Omega公司）进行石斛茎条内DNA的提取；用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒（批号AP-PCR-4G，英国Axygen公司）来回收目的片段；ITS的测序在Illumina NovaSeq高通量测序平台（杭州联川生物技术股份有限公司）进行。

2 方法

2.1 铁皮石斛株高、茎长和茎粗测量及差异性分析

利用直尺共测量112丛（GZDS、AHHS、YNML分别为34、25、53丛）铁皮石斛的株高，并从每丛铁皮石斛中随机选取3根茎测量茎长、茎粗。对茎长和茎粗平均值以及株高进行正态性检验，符合正态性检验后利用R语言中bartlett. test函数进行方差齐检验，不符合正态性检验应用R语言coin包中kruskal. test函数进行多样本秩和检验，＜0.05表示差异具有统计学意义，方差齐后应用R语言中aov函数进行方差分析，方差不齐时应用R语言中利用oneway test进行方差分析（＜0.05具有统计学差异）。

2.2 内生真菌DNA的提取

按照E.Z.N.A.®Soil DNA试剂盒说明书对次氯酸钠法消毒灭菌后的铁皮石斛茎提取内生真菌DNA。提取得到的DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。

2.3 DNA的测序

使用引物ITS1 FI2（5’-GTGARTCAT- CGAATCTTTG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATT- GATATGC-3’）对真菌（ITS2）可变区进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒对目标片段进行回收。纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen ds DNA Assay Kit在Qubit（美国Invitrogen公司）荧光定量系统上对文库进行定量。根据测序所需要求制备合格的文库，使用NovaSeq测序仪进行2×250 bp的双端测序。

2.4 测序数据注释与分析

根据双端序列的重叠区，采用Pear将R1、R2序列拼接成长的tag序列，并使用cutadapter去除barcode以及引物序列，然后Fqtrim（v0.94）过滤低质量序列，采用Vsearch（v2.3.4）过滤嵌合体，通过区分扩增子降噪算法（divisive amplicon denoising algorithm 2，DADA2）去重复后得到特征表和特征序列。物种注释采用QIIME2的插件feature-classifier进行序列比对，比对数据库为SILVA和unite数据库，以SILVA数据库注释结果为准。使用QIIME2流程进行α多样性分析，用R（v3.5.2）对测得数据进行统计分析及作图。α多样性分析利用Anova法进行整体差异分析、利用Wilcox Test法对不同产地铁皮石斛茎的内生真菌群落物种多样性指数之间的差异性进行研究。

2.5 内生真菌与铁皮石斛形态特征相关性分析

对27个ITS测序的铁皮石斛的株高、茎长和茎粗数据进行统计学分析，方法同“2.1”项。应用R语言kruskal. test函数对不同产地ITS测序数据注解到的共有内生真菌进行多重比较，FSA包中的dunnTest函数对多重比较结果-value进行矫正，共有内生真菌为不同产地2/3以上样本能检测到的内生真菌。另外，应用R语言PerformanceAnalytics包（R version 3.6.1）将具有统计学差异的农艺性状与不同产区共有差异内生真菌做相关性分析，相关性计算采用spearman方法。

3 结果与分析

3.1 铁皮石斛农艺性状测量及差异性分析结果

对3个产地共112份材铁皮石斛石斛的株高、茎长和茎粗进行测量，分析不同产地间这些农艺性状指标的差异性，结果如图1所示。3个产地中，YNML铁皮石斛的株高（18.3～49.2 cm）和茎长（18.73～61.00 cm）显著高于其他2个产地（＜0.05），其他2个产地之间株高、茎长差异没有统计学差异。此外，AHHS铁皮石斛的茎粗（4.04～7.40 mm）显著低于其他2个产地，具有统计学意义（＜0.05），而其他2个产地之间茎粗没有统计学意义。

图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著，相同字母表示不显著

3.2 铁皮石斛茎中内生真菌群落结构组成分析结果

对27个样品中测序获得的原始数据质控、过滤和拼接后共得到2 235 602条有效序列，平均每个样品产生82 800条有效序列，90.41%的有效序列在200～300 bp，且序列的有效率均在90%以上。各样品的测序质量结果如表1所示，说明该次测序结果具有较高的可信度。

表1 测序数据质量评估

按产地将测序数据注解的内生真菌进行组成分析发现，3个产地的铁皮石斛内生菌可注释为子囊菌门（Ascomycota，92.57%）、担子菌门（Basidiomycota，6.30%）、子囊菌类门（Asmycota，1.00%）组成（图2-A），其中子囊菌类门（Asmycota）仅存在于AHHS产地样品中。

图2 内生真菌在门(A)、属(B) 水平的组成

进一步分析发现，铁皮石斛内生真菌分布于138个属，其中AHHS分布94属，GZDS分布65属，YNML分布35属。内生真菌属的丰度在不同产地间具有差异，对相对百分数前20属进行分析（图2-B），结果显示AHHS产地丰度最高的为石座菌属Malloch & Cain（15.45%），GZDS产地丰度最高的为小戴卫霉属Crous & U. Braun（14.99%），YNML产地丰度最高的为小戴卫霉属（33.76%）。对共有菌属进行分析发现，根坚囊菌属D.F. Farr（12.16%）、链格孢属Nees（4.9%）、石座菌属（15.45%）在AHHS产地中的丰度远高于其它2个产地；不整小球壳属Kleb.（8.86%）、黑团孢属Tode（15.23%）在GZDS产地中丰度明显高于其他2个产地；枝顶孢属Link（9.40%）在YNML产地中丰度明显高于其他2个产地。此外，接柄孢属Mont.（3.06%）、毛壳菌属Kunze（4.30%）为GZDS产地的特有属内生真菌。

3.3 内生真菌群落多样性分析结果

使用QIIME2流程对样品中内生真菌的α多样性指数进行分析，用箱线图来展示不同产地铁皮石斛茎中内生真菌的观察特征值和香农指数。从观察特征值图中（图3-A）可以看出，3个不同产地的内生真菌群落丰度存在差异，观察特征值表明，3个产地features丰度从高到低依次为AHHS、GZDS、YNML；从香农指数箱式图（图3-B）中可以看出，AHHS的内生真菌多样性明显大于其他产地，其次为GZDS、YNML，其中AHHS与GZDS 2个产地的内生真菌多样性具有显著性差异（＜0.05），AHHS与YNML 2个样本组的内生真菌多样性具有显著性差异（＜0.05），GZDS与YNML 2个产地的内生真菌多样性没有明显的差异。

*表示在0.05水平差异显著

3.4 内生真菌与铁皮石斛农艺性状相关性分析

为了进一步探索铁皮石斛形态差异形成与差异内生真菌的关系，首先应用R语言将ITS测序样本铁皮石斛形态特征（株高、茎长、茎粗）进行差异性分析，发现不同产地的27丛材料的农艺性状差异显著性与总体样本的结果一致（表2）。

对不同产地铁皮石斛共有内生真菌组成进行分析，筛选出相对丰度排名前20且3个产地均有2/3以上样本都能检测出的内生真菌属进行多重比较，结果发现获得的5个共有属中仅赤霉菌属（Sacc.）在AHHS和YNML产地间具有显著差异（表3）。而AHHS和YNML产地的铁皮石斛在株高、茎长、茎粗农艺性状上均具有显著性水平差异（表2）。将赤霉菌属与铁皮石斛株高、茎长、茎粗进行相关性分析，发现赤霉菌属的丰度与宿主的株高、茎长和茎粗具有显著相关性（＜0.05），呈负相关（图4-A）。尖孢镰刀菌和为赤霉菌属中的2个种，进一步将尖孢镰刀菌和与宿主农艺性状作相关性分析，发现尖孢镰刀菌与宿主的株高、茎长和茎粗具有显著相关性（＜0.05），呈负相关；而菌仅与宿主的株高和茎长具有显著相关性（＜0.05），呈负相关（图4-B）。

表2 铁皮石斛农艺性状差异分析(, n = 9)

同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，相同字母表示不显著

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, while the same letters indicate no significant difference

表3 共有内生真菌的差异性分析

Table 3 Difference analysis of common endophytic fungi

unadj为未矫正值；adj为矫正后-value；表中*表示在0.05水平差异显著

unadj is uncorrected-value;adj is the corrected-value;*in the table indicates significant difference at the 0.05 level

*P＜0.05 **P＜0.001 ***P＜0.0001

4 讨论

本研究分析了不同产地人工种植铁皮石斛株高、茎长和茎粗的生长状况，比较了不同产地间人工种植铁皮石斛3种农艺性状的差异，并对内生真菌与农艺性状进行相关性分析，明确了不同产地之间铁皮石斛主要农艺性状的差异以及茎中内生真菌的结构组成，初步探索了内生真菌与宿主农艺性状差异产生的相关性。本研究表明，不同产地间人工种植铁皮石斛株高、茎长和茎粗表现出显著差异，且与产地间共有内生真菌赤霉菌属丰度呈负相关。

通过比较不同产地药用植物内生真菌结构，发现不同产地间内生真菌的种属组成不同、优势属不同。从门的水平上来看，不同地区的铁皮石斛内生真菌被注释到子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌类门（Asmycota）。所有的样本中超过99%的内生真菌在门水平获得注释，说明本次注释具有很高的覆盖率。其中Ascomycota为相对丰度最高的门，依次为担子菌门和子囊菌门，这与毛益婷等[17]的研究结果相似，但在他们的研究中并未发现子囊类菌门。从属的水平上来说，在不同样本组中均存在明显的优势属，石座菌属为AHHS产地的优势属内生真菌，小戴维斯壳属为GZDS产地中内生真菌优势属，小戴维斯壳属为YNML样本组中内生真菌优势属。3个产地的研究结果均与陈泽斌等[18]认为构巢裸壳孢菌为铁皮石斛叶中内生真菌的优势真菌群的研究结果不同，这可能因为样本为不同组织或者不同生存环境有关。

对人参[19]、黄芪[20]等植物内生真菌群落结构及多样性分析表明赤霉菌属真菌的宿主较为广泛，其在植物中能引起宿主发病，如小麦赤霉病[21]、玉米穗腐病[22]和水稻恶苗病[23]等。本研究中，在3个产地铁皮石斛茎中属水平均检测到赤霉菌属真菌，在种水平被注释为尖孢镰刀菌和。其中尖孢镰刀菌菌株被证实对苜蓿幼苗根部病害的严重程度和生长有显著影响，尤其对苜蓿株高以及根系的影响较显著（＜0.05）[24]；而未有相关报道。在本课题组的研究中发现AHHS与YNML铁皮石斛株高、茎长和茎粗具有差异，其中这些茎的农艺性状与共有内生菌赤霉菌属具有显著负相关性，进一步对注释为赤霉菌属的尖孢镰刀菌和的2个种与宿主的农艺性状做相关性分析表明不同产地铁皮石斛农艺性状差异受尖孢镰刀菌和丰度的影响，从而引起AHHS与YNML产地铁皮石斛农艺性状差异。

综合以上分析看出，赤霉菌属内生真菌与植物农艺性状形成有密切关系，丰度越高影响越显著。此结果为当前人工种植铁皮石斛赤霉菌属病原菌生物防治具有重要指导意义，为提高人工种植铁皮石斛品质做出贡献。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Correlation analysis between endophytic fungal and agronomic traits infrom different habitats

LIU Chao-bo1, WEN Wei-e1, LI Zhao-gao1, LUO Ting-ting1, XU De-lin1, QIAN Gang1, HE Yu-qi2, LI Lin1

1. Department of Cell Biology, School of Preclincal Medicine, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China. 2. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China

To analyze the endophytic fungal communities and agronomic characters ofstems collected from different habitats, in order to provide the basis for the correlation studies between endophytic fungi and formation of variations agronomic traits of.A total of 112samples were respectively collected from Anhui Huoshan (AHHS), Guizhou Dushan (GZDS) and Yunnan Menglian (YNML) and surveyed for their agronomic traits. The endophytic fungi community structure was analyzed by ITS sequencing, and the correlation between the abundance of endophytic fungi in different habitats and the host agronomic traits were analyzed by R language.The difference analysis showed that there were significant differences in plant height, stem length and stem diameter offrom the three habitats (＜0.05). A total of 923 characteristic sequences of endophytic fungi were obtained by ITS assay, which could be annotated to three phylum, 138 genus. The distribution difference of endophytic fungi infrom different habitats were shown at genus level, and the diversities of AHHS fungal community were significantly different from that of other places. The relative correlation analysis showed there were negative correlation between endophytic fungusand the plant height, stem length, stem diameter of the host (< 0.05).The different agronomic traits formation of stems in different habitats were closely related to the changes in abundance of endophytic fungi which were common in.

Kimura et Migo; endophytic fungi; ITS sequencing; diversity analysis; agronomic trait; correlation analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2023)04 - 1236 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.024

2022-08-12

国家自然科学基金项目（31960074）；贵州省科学技术基金项目（黔科平台人才[2019]-027，黔科合平台人才[2017]5733-050，黔科合支撑[2019]2961号）；遵义市科技局遵义医科大学科学技术联合资金招标专项（遵义市合HZ字（2020）91号）

刘朝波，硕士研究生，从事中药材遗传改良与基因工程研究。E-mail: 1947261933@qq.com

钱 刚，从事植物细胞与分子遗传学研究。E-mail: qiangang69@sina.cn

李 林，从事中药材遗传改良与基因工程研究。E-mail: 191129104@qq.com

[责任编辑 时圣明]