针刺对慢性疲劳模型大鼠海马TLR4/NF-κB信号通路及星形胶质细胞的影响

封艳艳，蔡尚志，何江山，吴 婷，徐海燕，张 瑜，阎路达，李晶晶，周 鹏△

(1.广州中医药大学附属宝安中医院，广东 深圳 518133；2.中山大学附属第八医院，广东 深圳 518033)

慢性疲劳综合征(Chronic fatigue syndrome，CFS)也叫慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(Chronic Fatigue Immune Dysfunction Syndrome，CFIDS)，是一种与多个系统相关的慢性、复杂的病理状态，其特征是持续性疲劳和其他非特异性症状，如疼痛、睡眠障碍和注意力难以集中等，其疲劳状态可随精神或身体活动加重，仅靠休息无法改善[1]。CFS在发达国家的发病率明显高于发展中国家[2]，发病率呈现出逐年上升、发病年龄趋于年轻化的趋势[3]。CFS与快节奏高压力的生活和工作状态密切相关，其发病也严重影响着日常生活与工作[2]。目前西医学对CFS的治疗以对症治疗为主，尚无有效药物[4]。针刺治疗CFS疗效确切，但针刺干预的作用机制尚不明确。

研究者们认为其作用机制与免疫、神经、代谢与内分泌等密切相关[5-6]。其中外周及中枢免疫炎症反应失调是慢性疲劳综合征重要的发病机制[7]。1项系统性综述显示慢性疲劳综合征与免疫炎症途径激活相关，从而引起躯体性症状比如疲劳不适、自主神经症状、认知症状及痛觉过敏等[8]。星形胶质细胞是中枢神经系统中含量最为丰富的一类胶质细胞，可以感知并响应各种炎症信号，在生理状态下可保护或促进神经元的修复[9]。在多种病理条件下，Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)激活可触发下游信号通路激活NF-κB信号通路，释放炎性细胞因子导致神经炎症进而导致神经元受损[10]。星形胶质细胞可以通过吞噬并清除受损的海马神经突触从而修复神经元，维持神经传导环路的稳定[11]。可见，星形胶质细胞对维持神经突触可塑性具有重要意义。团队前期研究表明针刺治疗慢性疲劳大鼠可降低大鼠血清IL-10水平，通过影响炎性细胞因子来抑制慢性炎症，改善慢性疲劳的相关症状[12]。本研究进一步通过观察针刺对CFS大鼠行为学、TLR4/NF-κB通路及星形胶质细胞的影响，为针刺治疗CFS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级SD雄性大鼠30只，体质量150～180 g，购于广东省医学实验动物中心，合格证号：SYXK(粤)2018-0085。实验动物在广州中医药大学动物实验中心SPF环境中饲养，维持室内温度25 ℃，相对湿度50%，整体环境清洁安静，通风良好，定期更换垫料，自由饮食。

1.1.2 耗材及试剂 0.25 mm×25 mm安迪牌一次性无菌针灸针(贵州安迪医疗设备有限公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和预混型qpcr试剂盒(艾科瑞生物公司，批号AG21017、AG11706及AG11701)；anti-β-actin、anti-MyD88、anti-p-NF-κB p65、anti-NF-κB p65及anti-GFAP抗体(CST公司，批号4970S、4283S、3033S、8242S及80788S)；anti-TLR4抗体(Proteintech公司，批号：66350-1-Ig)；RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司，批号R0010)；山羊抗兔IgG H&L (HRP)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司，批号ab6721、ab6789)；高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪，批号CW0049)；DAB显色试剂盒(中山金桥，批号PV-6000D)；二甲苯、无水乙醇(麦克林，批号X820585、E809056)

1.1.3 仪器 台式低温离心机(Sigma公司)；荧光定量PCR仪(Roche公司)；化学发光仪(proteinsimple公司)；ZD-2008转移摇床(其林贝尔)；显微成像系统(奥林巴斯)；10、100、200和1 000 μL移液枪(Eppendorf公司)；梯度PCR仪、电泳槽、高电流电泳仪、电转染系统与全能型半干蛋白转印仪(Bio-Rad公司)。

1.2 建模与分组

实验大鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组与针刺组，每组10只。采用慢性束缚[13]制备CFS大鼠模型：将针刺组和模型组大鼠颈部、腹部及后肢用塑料扎带束缚于网格铁丝架上，每只束缚45 min，连续束缚14 d。对照组不进行造模刺激。第14天束缚结束后，根据高怀林“一般情况半定量评分表”进行评分，评分≥4分表明大鼠CFS模型建立成功，剔除评分<4分的大鼠。针刺组于第15天开始进行针刺治疗。本研究所有实验操作均在广州中医药大学动物实验中心完成。

1.3 干预方式

造模结束后即开始干预。针刺组大鼠用塑料扎带固定于网格铁丝架上，参照《实验针灸学》选取背部脾俞、肺俞和肾俞，均双侧取穴，选用规格为0.25 mm×25 mm的毫针，垂直进针3～5 mm，留针20 min，每隔10 min行针1次。1次/d，5 d为1个疗程，疗程间休息2 d，共针刺两个疗程。

1.4 旷场实验

在针刺干预前及针刺结束后，将大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的黑色壁、无顶盖的旷场试验箱，观察大鼠5 min内的活动情况，主要观察指标包括：①各组大鼠移动总路程；②各组大鼠运动平均速度；③各组大鼠跨格次数。

1.5 RT-PCR检测mRNA水平变化

每组提取3只大鼠左侧海马组织总RNA样本，具体操作按照说明书进行。按cDNA反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。按照荧光定量试剂盒配置反应体系，用表1引物进行实时荧光定量PCR。

表1 引物序列表

1.6 Western blot检测蛋白表达变化

将大鼠右侧海马组织研磨后使用RIPA裂解液提取蛋白，煮沸变性后进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白湿转至NC膜上。分别加入anti-TLR4、anti-MyD88、anti-p-NF-κB p65、anti-NF-κB p65及anti-β-actin一抗(稀释比例1∶1 000)在4 ℃冰箱孵育过夜。TBST洗涤后用稀释后的二抗在室温下孵育1 h，TBST洗涤。使用ECL发光液浸泡后在应用凝胶图像处理系统进行蛋白条带显影。根据相对灰度值公式(目的蛋白/β-actin灰度值)计算出目的蛋白的相对表达量。

1.7 免疫组织化学染色检测GFAP变化

将每组3只大鼠左侧海马组织固定包埋后制成4 μm厚的切片。石蜡切片脱蜡和水化后，PBS冲洗3次，将切片放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中，于高压锅内加热进行抗原修复，自然冷却后，按照说明书步骤进行阻断内源性过氧化物酶活性、封闭、滴加一抗(GFAP 1：50，4 ℃孵育过夜)及二抗，DAB染色、苏木素复染、自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察海马组织中GFAP的表达情况。采用ImageJ软件进行sholl分析。Sholl分析可以用于检测星形胶质细胞突起的分支模式，从而展示星形胶质细胞的形态特征。Sholl分析每组共选取3个样本，每个样本随机选取3个细胞进行分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 慢性束缚造模成功

慢性疲劳综合征大鼠以出现精神倦怠、嗜卧、皮毛稀疏失去光泽、眼神黯淡无光、身体逐渐消瘦、自主活动明显较少、眯眼明显、粪便稀与反应力明显降低等综合指标被认为是造模成功。经慢性束缚后的大鼠在第7天即开始出现饮食逐渐减少的情况。随着造模时间的增加，大便由正常变为便溏，行为状态由活泼变得精神倦怠，皮肤毛发由整齐、润泽变为枯黄无光泽，甚至部分大鼠出现毛发脱落的现象,慢性束缚14 d后，慢性束缚造模SD大鼠与对照组对比，对照组大鼠较模型组大鼠更加活泼，模型组大鼠毛发枯黄无光泽。见图1，提示造模成功。造模大鼠共20只，经“一般情况半定量评分表”评分后，评分≥4分的大鼠共12只，剔除评分<4分的大鼠，造模成功率为60%。

图1 两组大鼠毛发比较

2.2 针刺改善慢性疲劳大鼠运动能力

旷场实验结果显示，模型组大鼠较对照组大鼠在旷场中运动总路程、平均速度和跨格次数均降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。进一步提示慢性束缚模型造模成功。与模型组比较，针刺组大鼠在旷场中运动总路程、平均速度和跨格次数均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。提示针刺对大鼠慢性疲劳状态具有改善作用。见表2。

表2 各组大鼠旷场实验比较

2.3 针刺降低海马组织Tlr4、Nfkb mRNA水平

目前普遍认为慢性疲劳综合征的发生与炎症反应密切相关[14]，TLR4/NF-κB为调节炎症因子释放的关键通路，因此检测了大鼠海马组织中Tlr4、Nfkb mRNA的表达，Tlr4、Nfkb溶解曲线图如图2所示。模型组与对照组大鼠海马组织Tlr4、Nfkb mRNA相比，虽差异无统计学意义，但模型组表达呈升高趋势。与模型组比较，针刺组Tlr4、Nfkb mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，但有降低趋势。见表3。

图2 各组海马组织Tlr4、Nfkb mRNA溶解曲线图

表3 各组大鼠海马组织Tlr4、Nfkb mRNA表达结果

2.4 针刺抑制海马组织TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达

为进一步确认针刺对慢性疲劳综合征大鼠炎症相关通路的影响，利用Western blot技术检测了TLR4、MyD88与NF-κB等蛋白表达的变化。结果显示，与对照组比较，模型组TLR4、p-NF-κB表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，提示慢性疲劳大鼠海马组织处于炎症激活状态。与模型组比较，针刺组TLR4、p-NF-κB表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。提示针刺具有抑制TLR4/NF-κB通路激活的作用。针刺可能通过抑制TLR4/NF-κB通路激活改善慢性疲劳大鼠炎症状态，从而达到改善慢性疲劳症状的作用。

此外，检测了GFAP蛋白的表达，GFAP蛋白被认为是星形胶质细胞成熟的标志物[15]。结果显示，与对照组相比，模型组大鼠海马组织GFAP表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组GFAP表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。该结果提示CFS大鼠海马组织中星形胶质细胞可能处于抑制状态。见图3、表4。

图3 各组大鼠TLR4/MyD88/NF-κB等蛋白表达

2.5 针刺改善星形胶质细胞形态

根据以上结果发现CFS大鼠海马组织GFAP蛋白表达降低，针刺可以明显改善GFAP蛋白的表达。猜测针刺可能通过对星形胶质细胞功能的调节作用达到治疗CFS的作用。利用免疫组织化学染色检测了GFAP的表达情况见图4A，阳性表达的细胞呈现棕黄色，主要在细胞膜及细胞骨架上表达。结果同样提示模型组GFAP表达有减少趋势，而针刺能够改善CFS导致的抑制作用。利用sholl分析[16]对星形胶质细胞的形态进行模拟见图4B，结果显示模型组星形胶质细胞突起减少，而针刺组星形胶质细胞突起形态与对照组比较差异无统计学意义。对sholl分析的结果进行统计见图4C，结果显示，与对照组相较，模型组星形胶质细胞突起交叉数量显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，针刺组星形胶质细胞突起交叉数量显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。该结果同样提示了针刺对CSF大鼠星形胶质细胞具有调节作用。见图4。

注:(A)各组大鼠GFAP在海马区表达情况。(B)星形胶质细胞突起分支模拟图，模拟图中不同颜色代表突起分支的数量。(C)Sholl分析检测星形胶质细胞突起分支数量。与对照组比较，***P<0.01;与模型组比较，图4 各组大鼠免疫组化染色检测GFAP表达及Sholl分析结果

3 讨论

针刺疗法可缓解CFS症状，延缓疾病的发生和发展，其疗效已经在临床上得到验证[17]。而针刺治疗CFS的机制研究仍然处于探索阶段。现代研究表明，针刺可以通过降低血清当中炎症因子表达、调节免疫应答、改善神经内分泌水平与抗氧化应激等多种途径缓解CFS症状[5]。本课题组前期研究发现针刺可以通过调节CFS大鼠血清中免疫调节因子IL-10的表达，改善大鼠慢性疲劳相关症状[12]。此外，针刺对神经炎症局部微环境的调节作用也逐渐受到关注。研究认为，针刺可以增强炎症局部微环境的网络连接，增强神经电生理信号的传递以更好地发挥治疗疾病的作用[18]。基于此，猜测针刺治疗CFS的机制可能与其炎症抑制作用以及增强炎症局部信号传递相关。

CFS的发病原因复杂多样，其病理机制可能涉及到免疫、代谢、神经内分泌与心理因素等多个方面，但CFS最终都会表现为神经炎症微环境的产生[19-20]。星形胶质细胞是一类哺乳动物脑内分布最广泛的细胞。生理状态下，星形胶质细胞伸展充填在神经元胞体及其突起之间，对神经元起着支持、引导和分隔作用。此外，星形胶质细胞还可以分泌一些神经营养因子和细胞因子，调节神经元功能并对受损神经元进行修复[21]。星形胶质细胞在神经炎症微环境的发生发展中起着关键的作用，其对炎症的调控具有双向作用，调控的关键在于局部微环境的变化。在炎症状态下，小胶质细胞释放的IL-1β等促炎因子会激活星形胶质细胞的NF-κB信号通路释放IL-6、CXCL-10等促炎因子促进神经炎症的产生。同时，星形胶质细胞还能感受TGF-ɑ信号，促进TGF-β的释放达到抗炎作用[22]。可见，星形胶质细胞对神经元的作用取决于局部微环境的状态。

本研究通过慢性束缚的方式构建大鼠CFS模型，针刺背俞穴对CFS大鼠进行治疗。通过观察大鼠行为学变化确定了针刺对CFS大鼠的症状具有改善作用。利用RT-PCR技术检测了炎症通路的关键基因Tlr4、Nfkb的表达，结果显示模型组有增高趋势，而针刺组大鼠与对照组相比则差异无统计学意义(P>0.05)。使用Western blot技术检测了TLR4、p-NF-κB/NF-κB及MyD88等蛋白的表达，结果显示与对照组相比模型组TLR4、p-NF-κB蛋白显著增加，而针刺组与模型组相比TLR4、p-NF-κB蛋白的表达显著降低，说明针刺对TLR4/p-NF-κB炎症通路具有抑制作用。模型组GFAP蛋白表达较对照组显著降低，提示了在CFS状态下，星形胶质细胞的功能受到抑制，而针刺能够上调CFS大鼠GFAP的表达。CFS状态下，星形胶质细胞的突起交叉数量减少，而针刺则能够修复CFS大鼠星形胶质细胞的形态。星形胶质细胞的突起是与神经元突触连接沟通的重要途径，通过修复星形胶质细胞的突起结构，可以促进星形胶质细胞对损伤神经元的修复[11]。以上结果表明，针刺可能通过抑制CFS大鼠神经炎症，调控星形胶质细胞的形态和功能从而达到改善CFS相关症状的作用。

本研究发现针刺既可以抑制CFS大鼠海马区的神经炎症，同时对星形胶质细胞进行调控从而治疗CFS。神经炎症微环境存在着复杂的调控网络，小胶质细胞、星形胶质细胞与神经元等细胞在炎症微环境中相互作用、相互影响[23]。一定程度的炎症和自身免疫对维持中枢神经系统的最佳功能是必要的，但过度的炎症或免疫反应则会导致神经元受损[24]。针刺由于其多靶点的优势，可以对复杂的炎症微环境进行快速有效的正向调节作用。针刺对CFS的治疗作用，究竟是通过直接影响NF-κB的激活还是通过对小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元等细胞多靶点调控来达到抗炎作用，还需要接下来更加深入地研究。