线粒体DNA在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用研究进展△

侯小玉 接传红 王建伟 刘自强 邓 宇 李媛媛 蔡文静

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的微血管并发症之一,约1/3的糖尿病患者会发生DR[1]。DR是工作年龄人群中不可逆视力损害和失明的主要原因[2]。DR发病的确切机制尚不清楚,持续的高糖环境下,慢性炎症、氧化应激、晚期糖基化终末产物形成和蛋白激酶C活化等机制均可引起视网膜微血管结构和功能改变[3]。近年来,国内外学者研究发现,线粒体功能障碍在DR的发生发展中发挥重要作用[4]。作为细胞能量的工厂,线粒体不仅是真核细胞通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)的场所,而且还参与细胞的代谢、增殖和凋亡等生物进程[5]。视网膜富含血管和神经组织,需要大量的氧气和ATP以维持视功能[2]。线粒体结构和功能的完整性对于维持视网膜的正常代谢至关重要。

线粒体功能障碍以视网膜线粒体DNA(mtDNA)损伤、线粒体电子传递链异常、ATP 合成减少、线粒体膜通透性改变以及线粒体质量系统失衡为基本特征[6]。mtDNA作为线粒体的遗传物质,包含与电子传递链有关的蛋白编码基因[7]。由mtDNA损伤所引起的线粒体功能障碍,可直接或间接地影响细胞的正常功能[6]。既往已有研究证实,mtDNA的改变与DR密切相关[8]。在有关DR的细胞和动物模型中,可以观察到高糖环境下的mtDNA损伤先于视网膜微血管损伤[9]。在DR的发病过程中,慢性高糖环境下,氧化应激、表观遗传学改变等机制所引起的视网膜mtDNA受损加速了视网膜毛细血管中血管周细胞和内皮细胞的凋亡,导致无细胞毛细血管的形成和视网膜微循环功能障碍,造成视网膜缺血缺氧,而这又进一步导致了新生血管的形成[10-11]。虽然mtDNA损伤是DR发展过程中的早期事件,但对mtDNA损伤的深入研究可以为靶向治疗线粒体功能障碍以及延缓DR的进展提供新的研究方向。本文将分别从mtDNA的甲基化改变、氧化损伤、复制与修复系统受损、基因突变等方面进行综述,探讨mtDNA在DR发病机制中的作用。

1 DR与mtDNA甲基化

DNA甲基化在DR中扮演重要角色。作为表观遗传修饰最原始的一种形式,DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化作用,将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到CpG二核苷酸簇胞嘧啶碱基的第五个碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶(5mC)[12]。尽管哺乳动物基因组的甲基化是一种自然现象,但是CpG区域高甲基化使DNA结构的稳定性和DNA与蛋白质相互作用方式发生改变而抑制基因的表达[11]。DR的发病过程往往伴随DNA甲基化水平的升高[13-14]。与无视网膜病变的糖尿病患者相比,DR患者DNA甲基化水平明显升高,尤其是与基因沉默相关的CpG岛的甲基化水平明显升高[15]。

DNA甲基化对mtDNA基因组的表观修饰影响mtDNA的稳定性[11]。在糖尿病状态下,随着视网膜 5mC水平的增加,mtDNA甲基化水平升高,尤其是D-loop区的甲基化水平明显高于其他区域[16]。而视网膜mtDNA甲基化的增加会影响编码电子传递链的相关基因的表达,使电子传递链功能受损影响ATP的产生,而电子传递链功能障碍又会进一步导致氧自由基(ROS)的增加[15]。此外,DNA甲基化和碱基配对之间存在串扰现象。Mishra等[17]的实验研究表明,通过抑制高糖环境下人视网膜血管内皮细胞中mtDNA甲基化可以减少D环碱基错配,从而避免线粒体损伤。

2 DR与mtDNA氧化损伤

8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基导致DNA氧化损伤的产物。细胞线粒体内8-OHdG水平是线粒体氧化损伤标志物之一。过量的ROS可以引起mtDNA损伤,导致8-OHdG表达增加[18]。线粒体既是ROS的主要来源,也是ROS氧化损伤的主要靶位[19]。线粒体ROS主要在电子传递链的氧化磷酸化过程中产生[18]。正常情况下,在谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等内源性抗氧化剂的控制下,一定水平的ROS参与细胞信号通路转导,在促进细胞的增殖和分化等生物进程中发挥重要作用[20-21]。然而在慢性高血糖的刺激下,多元醇通路、氨基己糖通路和蛋白激酶C等的激活以及晚期糖基化终末产物的堆积和抗氧化防御系统的破坏均会造成视网膜中大量的ROS产生导致氧化应激增加[10]。在线粒体中,mtDNA的位置和ROS产生场所较近,而且mtDNA不像核DNA那样具有可靠的修复系统,所以mtDNA更加容易受到ROS的攻击。与mtDNA的任何其他区域相比,D环处的损伤更为广泛[22]。一方面,过度产生的ROS引起mtDNA受损,影响线粒体的基因表达,电子传递链系统受损,导致线粒体的膜电位降低出现线粒体功能障碍,并且诱导细胞凋亡,促进DR的发生[23]。另一方面,mtDNA受损又进一步引起ROS生成增加,从而形成“恶性循环”[19,24]。Bugger等[19]的研究发现,高糖诱导下的人视网膜血管内皮细胞8-OHdG水平升高,ROS生成增加,线粒体呼吸链相关辅酶的表达下调,细胞凋亡增加。即使将细胞转移到正常葡萄糖环境下,这种改变仍然持续存在,提示mtDNA氧化损伤可能通过ROS过量产生的“恶性循环”参与DR有关的代谢记忆现象。除线粒体外,细胞浆NADPH氧化酶的激活也产生ROS。研究发现,糖尿病状态下的视网膜及其微血管系统中细胞质ROS的增加是一个早期事件,它先于线粒体损伤和视网膜组织病理学的改变[25]。在DR的发病过程中,伴随Rac1-Nox2轴的激活,细胞质ROS生成增加进一步加重了mtDNA的损害[26]。

高糖刺激可诱导mtDNA受损和ROS生成增加的“恶性循环”,而簇集的ROS会影响线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2家族的蛋白表达[26]。相关体内外研究己证实线粒体凋亡通路在高糖诱导的视网膜毛细血管周细胞凋亡过程中起着至关重要的作用[27]。细胞基质金属蛋白酶(MMPs)是一种与血管生成、血管重塑和凋亡相关的细胞外基质降解蛋白家族,线粒体或细胞质中ROS的增加可激活MMPs。在DR的早期,视网膜中MMP-9和MMP-2被激活。MMPs在热休克蛋白(Hsp70)的帮助下从细胞质转移到线粒体内,并通过调节Hsp60和间隙连接蛋白的表达,来损害线粒体的完整性,导致细胞色素C泄漏到细胞质中,启动凋亡机制[28]。锰超氧化物清除酶(MnSOD)的过度表达能降低MMP-2介导的线粒体损伤,从而抑制DR的发展。因此,抑制MMP-2活化的靶向治疗可能为DR的治疗提供新的研究方向[29]。此外,作为细胞内重要的信号分子,过度累积的ROS可逐渐激活NF-κB和MAPK等级联反应促进炎性因子的释放,诱导炎症反应,进一步加重DR疾病的进展[30]。

3 DR与mtDNA的复制与修复

线粒体内ROS持续增加会对mtDNA的复制产生影响[31]。由链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和小鼠视网膜血管内皮细胞中mtDNA复制酶、DNA聚合酶γ(POLG)和线粒体转录因子A(TFAM)减少,导致mtDNA拷贝数显著减少,而MnSOD可以通过调节线粒体超氧化物水平,改善D环损伤和抑制mtDNA复制酶、POLG和TFAM的减少,这表明D环损伤和mtDNA的复制受线粒体超氧化物过度积累的影响[32-33]。mtDNA的复制对于线粒体正常运作至关重要。由核基因编码的mtDNA复制酶和POLG参与了mtDNA的复制过程。POLG是线粒体碱基切除修复(BER)中的限速酶,POLG的失活可导致视网膜线粒体生物发生受损和拷贝数低于正常值[33-34]。在DR的动物模型和高糖培养的人视网膜血管内皮细胞中,POLG的启动子呈高甲基化,从而影响了线粒体的结构和基因组稳定性[35-36]。TFAM是维持 mtDNA 的完整性和调节mtDNA 损伤修复过程的重要因子[37]。TFAM可转移至线粒体,启动mtDNA的转录和复制。DR患者的视网膜线粒体中 TFAM水平降低,导致mtDNA、线粒体编码蛋白的合成及氧化磷酸化能力降低。Nanjaiah等[38]观察到TFAM在糖尿病大鼠的视网膜中被泛素化,阻碍了其向线粒体的转运,导致mtDNA转录低于正常水平和线粒体功能障碍,而抑制TFAM的泛素化有助于恢复线粒体稳态。

mtDNA修复和损伤之间的平衡对于线粒体稳态非常重要,为了修复受损的DNA,线粒体具有有效的DNA修复系统[39]。据报道,DR状态下视网膜血管内皮细胞线粒体中的Mlh1和OGG1的表达减少[40-42]。Mlh1可以消除错配,线粒体中Mlh1水平降低会导致错配修复系统的受损,从而导致序列变体增多[13]。Palozzi等[43]在链脲佐菌素诱导的DR小鼠模型中观察到视网膜中Mlh1的启动子被超甲基化,使mtDNA错配修复系统受损,加剧了mtDNA结构的不稳定性。OGG1是特异性 DNA糖基化酶之一,DNA 糖基化酶可以识别化学改变的碱基,从而切除受损的碱基,修复DNA 氧化损伤[44]。作为8-OHdG的同源修复酶,OGG1可以特异性识别和切除因氧化应激而产生的8-OHdG,从而防止由8-OHdG过度积累所导致的突变。因此,OGG1对于维持线粒体基因组完整性具有重要作用[45]。研究表明,在DR模型中,伴随视网膜中OGG1的表达降低,mtDNA损伤增加[46]。

由于mtDNA损伤和mtDNA复制与修复系统受损,mtDNA编码基因的转录减少,这将进一步损害电子传递链系统,这种线粒体损伤和mtDNA转录减少导致自由基产生的恶性循环,最终导致DR中视网膜毛细血管细胞的死亡[35]。

4 DR与mtDNA基因突变

mtDNA是一种具有16 569个碱基对的双链环状分子,包含13个与电子传递链有关的蛋白编码基因和24个RNA基因[10]。mtDNA中的一个特殊区域称为D-loop结构,该区域虽然不编码基因,但确是复制起始点和转录启动子所在[47]。由于缺乏组蛋白的保护,mtDNA的突变率比核DNA高10～100倍,并缺乏修复能力[48]。mtDNA突变引起的线粒体功能障碍被证实与DR有关。王思琦等[49]的研究发现,朝鲜族和汉族人群中线粒体ND4基因12026A→G突变与视网膜中央动脉血流动力学改变有关,并认为该基因突变是朝鲜族和汉族2型糖尿病患者发生DR的易感因素。Malik等[48]通过对比无DR患者和DR患者外周血液样本中mtDNA的突变率发现DR患者mtDNA的突变率更高。郭艳英等[50]的研究发现,与未携带mtDNA突变者相比较,mtDNA携带者发生DR的时间更早。上述mtDNA突变可能通过影响线粒体的mtDNA的转录和翻译以及氧化磷酸化,导致细胞代谢改变,进而参与DR的发生发展过程,但是有关mtDNA的具体突变位点与其功能影响的关系仍需要进一步的研究。

DR受环境和遗传等多重因素的影响[3]。人类在环境等因素影响下不断产生mtDNA变异,这些变异在不同地域人群中逐渐积累,在遗传进化过程中形成不同区域人群独特的mtDNA遗传组分,称为mtDNA单倍型类群[51]。特定mtDNA单倍群已被证明与衰老和多因素年龄相关疾病有关,如阿尔茨海默病、多发性硬化症和癌症等[51]。研究表明,线粒体单倍型类群(Mitochonial haplotype)与DR的发病有关[51]。周园媛[52]在对云南省2型糖尿病患者线粒体基因组突变的筛查中发现,mtDNA单倍型类群M9是该人群DR发病的独立保护因素,在其后续的实验研究中,通过胞质融合细胞技术对mtDNA单倍型类群进行研究,结果显示,单倍型类群M9特有的突变mt.T3394C可有效降低M7融合细胞的细胞质中ROS和线粒体超氧化物水平,提示该突变可能部分介导了单倍型类群M9对DR的保护。研究还发现,不同的mtDNA单倍型类群发生PDR的风险不同,Bregman等[53]的有关美国高加索人群的队列研究表明,与其他线粒体单倍型类群人群相比,单倍群H的患者更容易发生增生型糖尿病视网膜病变(PDR),而来自单倍群Uk的患者发生PDR的风险降低,并且认为这些单倍群的差异与PDR典型的新生血管形成有关。但是在Liu等[54]进行的大样本高加索人群队列研究中,线粒体单倍群与DR的发生和严重程度之间没有显著关联。Kofler等[55]认为,不同的mtDNA单倍群可能是通过改变氧化磷酸化和ROS的水平进而导致或避免DR发生的。上述有关mtDNA单倍型类群与DR的相关性的研究结果尚未达成一致,这可能与研究设计、病例和对照定义、统计分析、人群分层的差异有关。而且人类线粒体进化树由数百个单倍型类群组成,然而上述队列研究中所涉及的单倍型类群有限。此外,由于大多数线粒体蛋白是由核基因编码的,一些核基因的突变也可能会引起mtDNA的相关基因位点的突变[21]。因此,mtDNA单倍型类群对DR的影响还可能受到核基因调控的影响。

5 结束语

表观遗传学改变、氧化应激、mtDNA复制与修复系统受损和mtDNA基因突变等机制,最终导致电子传递链异常、ROS过度积累、氧化还原途径失衡,造成细胞线粒体功能障碍和细胞内稳态失衡,诱发视网膜血管周细胞和毛细血管的凋亡。虽然目前mtDNA损伤在DR发病过程中的机制尚未完全阐明,但是未来继续在分子生物学水平研究mtDNA损伤以及线粒体功能障碍对DR的作用,将有助于进一步了解揭示DR的发病机制,为制定预防和治疗DR提供新的策略。