苗药有柄石韦降血糖作用及其分子机制研究

常 姣，隋 怡，孙文娟，何韩娇，胡书苑，童平珍，易 旭，杨武德，龙 毅

(贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

有柄石韦(Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching)为水龙骨科石韦属植物，功效为利尿通淋、清肺止咳、凉血止血，主要用于治疗热淋、石淋、血淋等症[1]。最早收载于《神农本草经》，又名石剑箬、金背茶匙、石皮、石兰、肺心草等[2]。有柄石韦是常用的民族药之一，苗胞常称为“锐猫棍”、“黛口掌”(湖南湘西)或“啊咳知”(贵州铜仁)[3-5]，分布地区主要为贵州、四川、云南、湖南、湖北等地[6-7]。石韦的种源繁多，在众多品种的石韦中，有柄石韦相较于其他石韦具有成熟的栽培繁殖技术，自然界中的储量多，其黄酮类、多酚类、多糖类含量均较丰富，因其化学成分的多样性，从而决定其药理作用的多样性，石韦的药理作用为镇咳祛痰[8]、抗病毒[9]、抗泌尿系统结石[10-11]等，具有较大的研究价值。

糖尿病是因为胰腺中胰岛素分泌缺陷或胰腺的生物作用受损而造成的一种代谢性疾病，临床上以高血糖为主要特征[12]。课题组的前期研究[11]表明有柄石韦具有明显的利尿通淋的作用，而利尿作用实际上是药物对水代谢的促进作用，课题组推测有柄石韦对糖代谢也可能具有促进的作用，而这一推测得到了课题组前期的生物信息学研究的支持。故课题组计划研究有柄石韦降血糖作用及可能的分子机制。然而，网络药理学是近些年药物机制研究的重要方法，网络药理学是建立在计算机虚拟计算、高通量组学数据分析等技术基础上，利用了生物信息学方法，研究多成分-多靶点-多疾病的整合机制，因而具有整体性和系统性的优势，现广泛应用于中药复方及单味药的作用机制研究中[13]。故本试验利用高血糖小鼠模型，考查该药物对糖尿病小鼠血糖的影响，并利用网络药理学技术建立了“成分-疾病-通路”的网络药理学，探究其可能机制与相关靶点，为该药物的后期深入研究提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康雄性KM小鼠30只，体质量18～22 g，购自重庆腾鑫有限公司，合格证号SCXK(辽)2015-0001，于温度22～25 ℃、相对湿度50 %～60 %条件下，自由进食饮水。

1.2 药材

黔产有柄石韦(20210414)采集于贵州省贵阳市南明区仙人洞，并经贵州中医药大学生药学实验室杨烨副教授鉴定为水龙骨科植物有柄石韦的新鲜叶及根。

1.3 药品与试剂

柠檬酸、柠檬酸钠(2019022088，20190320)均购自天津市致远化学试剂有限公司；甲醇(20200301)购自重庆万盛川东化工有限公司。

链脲佐菌素(STZ)(1015D057)购自大连美仑生物技术有限公司；盐酸二甲双胍片(ABR2313)购自中美上海施贵宝制药有限公司；水合氯醛水溶液(1125A21)、多聚甲醛溶液(1217A21)均购自北京雷根生物技术有限公司；封闭山羊血清(sl038)、苏木素染液(G1080)均购自北京索莱宝科技有限公司；EDTA抗原修复液(ZLI-9068)、兔二步法试剂盒(PV-6001)、DAB显色液(ZLI-9031)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(BJ08089044)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 仪器

FA2204B型电子天平(上海天美天平仪器有限公司)；800Y高速多功能粉碎机(永康市博欧五金制品有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；306A血测仪(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；SHHW21.600AII三用恒温水箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；DM3000生物显微镜(德国徕卡仪器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1有柄石韦水提物的制备

取干燥有柄石韦粗粉100 g，置于圆底烧瓶中加入2倍量体积的蒸馏水浸泡30 min后，再加8倍量体积的蒸馏水没过药材，加热连续回流提取3次，每次1.5 h，趁热滤过，合并3次滤液，蒸发浓缩至0.5 g/mL，备用。

1.5.2糖尿病小鼠试验

1.5.2.1糖尿病小鼠模型的建立、分组与给药

SPF级雄性的KM小鼠30只，随机选取6只作为正常组，其余小鼠腹腔注射链脲佐菌素进行糖尿病模型的复制[14]，正常对照组腹腔注射同等剂量的柠檬酸缓冲液。72 h后测定FBG≥11.1mmol/L，视为造模成功。将造模成功后的小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、有柄石韦高、低剂量组(0.5 g/kg、1.0 g/kg)，每组6只。灌胃(i.g)给药，连续14 d，其中正常组及模型组灌胃等体积的蒸馏水。

从给药开始后，每天监测小鼠体质量、饮食饮水量的变化情况，并分别于造模前，及造模成功给药后第7天、14天测定血糖，对比给药前后血糖含量的变化。

小鼠给药14 d后处死，迅速取出胰腺组织，用生理盐水洗涤，吸干水分，迅速放入装有10 %多聚甲醛的离心管中(液体∶组织=10∶1)，备用。

取出小鼠的胰腺组织，用10 %中性多聚甲醛进行固定，经过脱水、透明、包埋、切片和封片后，进行HE染色，光学显微镜镜检，图像采集后分析。

组织切片进行脱蜡至水，切片置于pH 8.0的EDTA缓冲液进行热修复，滴加适量10% H2O2溶液，避光室温孵育15 min，使用PBS冲洗。滴加5 %～10 %正常羊血清，室温孵育5 min，PBS冲洗。加入一抗工作液后置于4 ℃冰箱中孵育过夜，PBS冲洗。滴加辣根过氧化物酶酶标二抗(HRP)，在室温下孵育30 min，PBS冲洗。1 mL DAB缓冲液中滴加1～2滴DAB原液，混匀后滴加到切片上，镜下观察染色程度。浸入蒸馏水终止反应。苏木素复染，自来水充分冲洗。1 %酸化乙醇洗脱，自来水充分冲洗。氨水返蓝，自来水充分冲洗。采用70 %乙醇、90 %乙醇、无水乙醇各2 min进行梯度脱水干燥，二甲苯透明，风干后中性树脂封片。在显微镜下观察结果。

1.5.3统计分析

结果采用SPSS 26.0统计软件进行处理分析，计量资料用(x±s，n=6)来表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示显著差异，P<0.01表示极显著差异。

1.5.4网络药理学研究

1.5.4.1数据库

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP数据库https://tcmspw.com/tcmsp.php)；中药综合数据库(TCMID http://47.100.169.139/tcmid/)；Swiss ADME数据库(http://www.swissadme.ch/)；Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)；OMIM数据库(https://www.omim.org/)；Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；STRING数据库(https://cn.string-db.org/)；DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)；微生信数据库(http://www.bioinformatics.com.cn/basic)

运用TCMSP、Swiss ADMD数据库以及查阅文献检索石韦、有柄石韦、庐山石韦的化学成分，如三萜类[15-17]、黄酮类[18-20]、有机酸类[21-23]等，根据检索结果，根据限制条件口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18进行筛选，得到有柄石韦的活性成分。采用Swiss Target Prediction和SEA数据库预测活性成分的作用靶点，将活性成分与预测靶点进行整合，删除重复项。

在Genecard数据中以“diabetes”为关键词，搜索糖尿病相关靶点的基因名，并以相关性评分大于等于中位数进行多次筛选，然后再与OMIM中搜索关键词“diabetes”检索得到的所有糖尿病相关靶点的基因名进行去重整合，从而得到糖尿病疾病靶点的基因名。

将有柄石韦对应的成分及靶点等汇总分类建立网络文件与属性文件，将两个文件导入Cytoscape3.9.1中，构建药物-成分-靶点网络图，以节点度值的大小进行可视化分析。

将药物成分靶点与糖尿病疾病靶点通过Venny2.1.0将两者的靶点进行绘制韦恩并取交集，整理共同的靶基因。交集靶点分别和有效成分韦恩交集并取交集靶点，最后汇总所有交集靶点信息。导入Cytoscape3.9.1软件中进行可视化分析。

将交集靶点导入STRING 11.5数据库中构建PPI网络，根据自己需求进行物种类别及阈值设置，分别为“Homo sapiens”，“medium confidence(0.400)”，以TSV格式导出结果，Cytoscape3.9.1软件进行可视化分析。

为了了解成分与疾病的交集靶点可能涉及到的信号通路、生物进程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)等信息，将“1.5.4.5项”下的结果导入DAVID数据库中，以“OFFICILA_GENE_SYMBOL”为标识符，以“Homo sapiens”为物种进行GO分析和KEGG信号通路富集分析，下载分析文件，按照Pvalue值排序，最终设定阈值为P<0.05，筛选相关信息，分析结果以气泡图形式予以展示。

根据“1.5.4.7”项下的结果，构建药物-靶点-通路-疾病网络，找出通路对应靶点，以及靶点对应有效成分，将其文件导入Cytoscape 3.9.1软件中进行可视化分析，根据度值大小筛选出核心成分及靶点。

2 结果与分析

2.1 糖尿病小鼠试验结果

2.1.1糖尿病小鼠的一般指标

与正常对照组相比较，模型组小鼠毛色灰暗，反应迟钝，出现多饮多食多尿的现象，垫料潮湿。给药14 d后，各给药组小鼠体重明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，如表1所示。饮食饮水量变化不明显，差异不具有显著性差异(P>0.05)，如表2所示，说明有柄石韦能够使糖尿病小鼠体质量逐渐增加，但短时间内不能有效改善糖尿病小鼠饮食饮水量。

表1 糖尿病小鼠体质量Tab.1 Results of body weight(food intake and water intake of diabetic mice)

2.1.2糖尿病小鼠FBG的影响

由表3结果可知，模型组小鼠的FBG值较正常组小鼠的FBG值明显升高(P<0.05)；给药7 d，模型组小鼠的血糖显著升高，各给药组之间无显著性差异。给药14 d后，与模型组比较，各给药组小鼠的FBG降低，差异具有极显著性差异(P<0.01)，说明有柄石韦水提物能有效降低糖尿病小鼠FBG，见图1。

表3 糖尿病小鼠给药后FBG结果Tab.3 Results of FBG in diabetic mice after administration

图1 糖尿病小鼠给药第二周FBG结果柱状图Fig.1 Histogram of FBG results in diabetic mice at the second

2.1.3糖尿病小鼠胰腺组织HE染色病理切片观察

结果如图2，和正常组相比较，模型组小鼠的胰岛β细胞核皱缩，排列不规则，边界不明显；与模型组小鼠相比较，给药组小鼠的胰岛β细胞明显改善，细胞形态较完整，细胞边缘较清晰。结果表明，有柄石韦可以改善糖尿病小鼠胰腺组织的病理损伤，且高剂量组小鼠胰腺改善更明显。

注：a、b、c、d、e分别为正常组、模型组、二甲双胍组、有柄石韦低剂量组、有柄石韦高剂量组。图2 糖尿病小鼠胰胰腺组织HE染色观察结果(40X)Fig.2 HE staining of pancreatic tissue in diabetic mice(40X)

2.1.4糖尿病小鼠胰腺组织免疫组化胰岛素的表达

模型组小鼠的胰岛细胞数目较正常组明显减少，其结果与HE染色的结果一致，此外，还可以观察到胰岛内胰岛素的表达明显减少；与模型组比较，给药后，胰岛内胰岛素的表达有不同程度的增加(图3)。

注：a、b、c、d、e分别为正常组、模型组、二甲双胍组、有柄石韦低剂量组、有柄石韦高剂量组。图3 糖尿病小鼠胰腺组织免疫组化观察(40X)Fig.3 Immunohistochemical observation of pancreatic tissue in diabetic mice (40 X)

2.2 网络药理学结果

2.2.1有柄石韦有效成分及靶点筛选

通过查阅文献，以及在数据库TCMSP与Swiss ADME中，以OB≥30%，DL≥0.18作为筛选条件，最后筛选出有柄石韦中的9种成分β-谷甾醇、芒果苷、山奈酚、奎宁酸、圣草酚等纳入后续研究(表4)，并采用Swiss Target Prediction 和SEA数据库预测活性成分的潜在作用靶点，将活性成分与预测靶点进行整合，删除重复值后得到321个成分靶点。

表4 有柄石韦主要有效成分Tab.4 Main active components of P.petiolosa

2.2.2糖尿病靶点筛选

以“糖尿病”为关键词在Gene Cards、OMIM数据库挖掘出所有相关靶点，并下载数据，根据中位数进行多次筛选后得到1687个靶点，成分靶点与疾病靶点交集后，共有82个交集靶点。

2.2.3靶点网络图构建

将上述检索到的药物有效成分及对应的靶点构建有柄石韦药物-成分-靶点网络图，由330个节点和589条边组成结果，如图4所示。再将交集靶点分别与9个有效成分靶点进行交集，得到162个靶点，删除重复后得到82个靶点。使用Cytoscape3.9.1软件构建疾病-成分-靶点图，该网络由92个节点，171条边组成，按照度值进行排序，前三位为山奈酚(度值=30)、奎宁酸(度值=29)、圣草酚(度值=28)，网络中每个成分都对应2个及以上靶点，说明中药有柄石韦在治疗糖尿病时，是以多成分、多靶点的共同作用来实现的(图5)。

2.2.4PPI网络构建

将交集靶点导入STRING 11.1数据库构建初始PPI网络(a)，导入Cytoscape3.9.1软件进行优化优化后的网络由82个节点，745条边组成。选取度值大于30的15个核心靶点进一步优化，其网络图由15个节点，94条边组成，分别为：AKT1、HIF1A、PPARG、FGF2、PTGS2、GSK3、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、PTPN11、MMP9、MAPK3、VEGFA(图6)，这些靶点与其他靶点关联度密切，可能在治疗糖尿病占据重要地位，为治疗糖尿病的核心靶点。

注：a、b、c分别表示初始PPI网络图、优化PPI网络图、核心子网络图。图6 PPI网络图Fig.6 PPI network diagram

2.2.5KEGG信号通路分析和GO富集分析

将在DAVID数据库中分析得到的数据先按P-value值大小排序再以阈值为P<0.005筛选并在微生信中作图，如图7所示。KEGG富集分析共有93条信号通路满足要求，再根据count值选取前20条进行作图，结果主要涉及到癌症中的途径、阿尔兹海默症、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等信号通路(a)，前20条通路相关信息见表7；BP结果共有76个条目，主要涉及到RNA聚合酶Ⅱ启动子转运的负调控、信号转导、MAPK级联途径等生物学过程；CC结果共有10个条目，主要与质膜胞质侧的外部成分、分泌颗粒腔、富含ficolin-1的颗粒腔、晚期胞内体等细胞组分有关；MF结果共有31个条目，主要涉及到DNA结合、锌离子结合、序列特异性DNA结合、ATP结合等分子功能。GO结果均取前10个条目作图(b)。

图7 KEGG(Top 20)和GO(Top 10)富集图Fig.7 enrichment diagram of KEGG(Top 20) and GO(Top 10)

表5 前20条核心靶点富集分析结果Tab.5 Enrichment analysis results of the first 20 core targets

2.2.6药物靶点-通路-交集靶点网络构建

根据“2.2.5”项的结果筛选出前20条通路所对应的靶点、靶点对应的有效成分，结果如图8所示。以介度、紧密度以及度值的大小进一步分析出有柄石韦治疗糖尿病的主要成分及核心靶点。结果显示主要成分是奎宁酸quercetin、山奈酚kaempferol、圣草酚eriodictyol、去氢二异丁香酚dehydrodiisoeugenol(表6)。核心靶点前15个为：AKT1、MAPK3、PIK3R1、MAP2K1、EGFR、RAF1、MTOR、VEGFA、IGF1R、MET、BRAF、SRC、GSK3B、FGF2、ESR1。与PPI网络的前15个核心靶点对比，有9个共同靶点(AKT1、FGF2、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、MAPK3、VEGFA)。

图8 药物-靶点-通路-疾病网络Fig.8 Drug-target-pathway-disease network

表6 有效成分网络拓扑学参数Tab.6 Active ingredient network topology parameters

3 结论与讨论

本次试验发现，有柄石韦水提物能有效降低STZ所致糖尿病小鼠的FBG，对胰岛细胞具有保护与修护作用，并能在一定程度上促进胰岛素的分泌。

网络药理学中KEGG富集通路结果显示有柄石韦治疗糖尿病的过程可能与癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等有关，且与AKT1、FGF2、SRC、EGFR、MTOR、ESR1、PIK3R1、MAPK3、VEGFA靶点密切相关。PI3K-Akt信号通路与许多重要的生命活动比如细胞的生长、凋亡等密切相关[24]。迟毓婧等[25]的研究中发现PI3K-Akt信号通路是胰岛素调控血糖平衡的关键通路之一。研究显示，PI3K-Akt信号通路与胰岛素抵抗(IR)相关疾病的关系密切，胰岛素以及其他相关因素的刺激会导致PI3K和Akt的上调，均可启动整个PI3K-Akt信号通路的传导[26，27]。而AKT1蛋白参与多种生物学过程，如细胞的增殖、生长、胰岛素信号传导等方面密切相关[28]，且它激活依赖PI3K途径，试验结果也显示了有柄石韦对胰岛β细胞具有增殖、修复作用，故推测靶点AKT1可能是有柄石韦治疗糖尿病的关键靶点，从而使有柄石韦对胰岛β细胞进行修复来达到降血糖的目的。