茶用菊花‘金丝皇菊’的组培快繁技术研究

崔乐源，盛夏薇，郭佳琳，陈婧钿，孙宪芝

(1.山东农业大学 作物生物学国家重点试验室,山东 泰安， 271018；2.山东农业大学 园艺科学与工程学院，山东 泰安，271018)

随着人们生活水平的不断提高，茶用菊花得到越来越多的关注与使用，针对茶用的菊花品种也不断涌现，其中‘金丝皇菊’以朵大、花型美丽、富含黄酮、氨基酸和微量元素等优点而成为生产上的最重要品种之一[1]。有清热解火和消暑的功效，是一种兼具观赏和药用价值的作物[2]，具有较高的市场价值。

菊花是异质六倍体，因其遗传背景复杂，自交不亲和且杂交性状分离严重，在自然状态下结实率极低，不太可能通过自交获得自交系[3-4]。因此，目前菊花的繁殖主要是扦插和分株等无性繁殖方式[5]。传统的方式需要较多的母株材料、繁殖周期长、易受季节和外界环境的影响，随着市场需求量的日益增加，传统方式已无法满足市场发展的需要[6]。组培快繁技术可以通过根、茎、叶等器官大量诱导组培苗，具有培养周期短、繁殖速度快、保持母本优良性状、不受季节及地区等因素的影响、可周年连续生产等优势[7-8]。一方面，组培可以对菊花进行脱毒复壮，保持有优良性状，短时间大量繁殖，满足市场需求；另一方面，组培可为新品种的选育和转基因操作奠定基础。

目前国内对菊花组培快繁的研究报道很多，如切花菊‘白扇’[9]和‘太行菊’[10]。但‘金丝皇菊’的组培快繁技术还未见报道。本研究开展了‘金丝皇菊’的外植体消毒、诱导培养、生根培养及炼苗移栽，获得了‘金丝皇菊’组培苗最适培养基配比，对加快‘金丝皇菊’的繁殖速度，满足市场需求，促进产业发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘金丝皇菊’当年生茎段。材料取自山东农业大学园艺学院研究基地。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 选取生长良好、无病虫害的‘金丝皇菊’带芽嫩枝作为外植体，流水冲洗2 h，剪去叶片，放于超净工作台上。用75%乙醇浸泡30 s，快速取出，无菌水冲洗3次，放入不同浓度（5%、15%、25%）的次氯酸钠溶液中分别消毒20 min，消毒过程中不断振荡烧杯。无菌水冲洗5次后用滤纸吸干水分，将外植体切成带有1~2个腋芽的茎段，接种在不加激素的空白培养基中，每组消毒处理3个重复。30 d后对褐化率、染菌率和外植体的生长情况进行统计分析，筛选出一个适宜的消毒方式。生长情况包括诱导芽的长势、叶片颜色与大小等。

1.2.2 诱导培养 以MS培养基为基本培养基，添加琼脂5.2 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，其中附加一定浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）、NAA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1）。以不加激素的MS培养基作为对照组。将消毒灭菌后的外植体剪成小段，每段带有1~2个腋芽，接种到含不同浓度激素的诱导培养基上，每个组培瓶1~2段。诱导培养基分16个处理组，每组4次重复。光照培养室温度为（25±2）℃，相对湿度为35%~40%，光照时数为12 h·d-1。培养28 d后，记录不同激素配比下产生的芽诱导率、平均出芽个数、不定芽形态结构是否良好数据。观察并分析诱导培养期‘金丝皇菊’组培苗的长势。

1.2.3 生根壮苗培养 将健壮的无根小苗转移到生根培养基上，培养基采用1/2MS为基本培养基，其中附加一定浓度的6-BA（0.5、1 mg·L-1）、NAA（0.1、0.2 mg·L-1）和活性炭（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）。以不加激素和活性炭的1/2MS培养基作为对照组。光照培养室温度为（25±2）℃，相对湿度为35%~40%，光照时数为12 h·d-1。培养28 d后，记录生根条数、根的长度、生根率等数据，评估生根情况，观察并筛选出最适的生根培养基。

1.2.4 炼苗移栽及苗圃管理 组培苗高和根长均在7 cm左右即可开始炼苗，先打开组培瓶口套上自封袋，移到自然光下2~3 d，让试管苗接受正常光照射，使其长得更加壮实。2 d后将自封袋扎孔，适应3~4 d后撤掉自封袋，继续炼苗2~3 d。

炼苗后将小苗从组培瓶中小心取出，轻柔地洗净根部附着的琼脂，尽量保留须根，将根部浸入多菌灵稀释液中消毒15 min，移栽到经75%酒精消毒过的营养土与园土(1∶1)混合的基质中。最初阶段注意遮阴、保温，空气相对湿度与培养基保持相似。14 d后统计移栽成活率，对移栽状况进行评估。

1.2.5 数据统计分析 具体公式如下：

外植体消毒、诱导培养、生根培养等所获得的数据，采用Excel 2013和SPSS25.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 消毒剂浓度对初代培养效果的影响

由表1可知，接种30 d后，5%次氯酸钠消毒的染菌率最高；25%次氯酸钠处理的褐化率较高；而15%次氯酸钠处理的染菌率最低，组培苗长势最好，叶片浓绿无枯萎，且差异显著。因此，‘金丝皇菊’初代培养的最佳表面消毒条件为15%次氯酸钠消毒20min。

表1 不同消毒剂浓度对‘金丝皇菊’初代培养的影响

2.2 激素配比对组培苗诱导的影响

由表2可知，接种28 d后，所有试验组的外植体基部均出现了愈伤组织，但各组的愈伤组织分化情况有所不同。当NAA浓度为0.2、0.3 mg·L-1时，诱导的愈伤组织数量较多，说明NAA浓度较高不利于不定芽的诱导，容易产生畸形芽，长势不佳。当6-BA浓度在0.5~2.0 mg·L-1时，均诱导出不定芽。当6-BA浓度为2.0 mg·L-1、NAA浓度为0.3 mg·L-1时芽诱导率达到100%，平均出芽个数为6.75个·株-1，显著高于CK处理，组培苗更健壮、叶色浓绿，基部的愈伤组织呈黄绿色。因此，‘金丝皇菊’初代培养中培养基的最佳激素配比为MS+2.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA。

2.3 激素配比对组培苗生根的影响

由表3可知，对13组和15组进行比较，结果得出13组培养基中侧根更多、根部更粗。对9组和12组进行比较、13组和16组进行比较，生长素与细胞分裂素比值相同，浓度越高，根萌发条数越少，形态越细长。对1组、5组、9组、13组进行比较，得出随着活性炭含量的增加，分化出的根数也逐步增加（图1）。

表3 不同培养基对‘金丝皇菊’组培苗生根的影响

图1 生根情况

当6-BA浓度为0.5 mg·L-1、NAA浓度为0.1 mg·L-1、活性炭含量为0.4%时生根率达到100%，平均生根条数达到17.67条·株-1，显著高于CK处理，产生的组培苗根部更长，更粗壮，侧根极多。因此，‘金丝皇菊’生根培养中培养基的最佳配比为1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.4%活性炭。

2.4 炼苗与移栽及田间管理

笔者经观察发现，撤掉自封袋后继续炼苗时间的长短会影响组培苗的成活率。由图2可知，撤掉自封袋后，培养基水分迅速蒸发，若不能及时移栽，会导致培养基过度干燥。炼苗后的‘金丝皇菊’组培苗仅在1周左右即长出新根，植株高度也快速增加,茎呈嫩绿色、粗壮，此时可进行移栽。

图2 继续炼苗3 d（A）与继续炼苗1.5 d（B）

移栽前，在清洗苗根部的培养基时，11组和12组的根太细，容易断开，对根部损伤较大；10组和13组的根相对较粗，较易与培养基分离，不易断根。由表4、图3可知，根部损伤较小的试验组移栽后更易存活、植株长势更健壮。

图3 11组（A）与13组（B）移栽14d后长势

表4 炼苗移栽后植株长势

3 讨论与结论

3.1‘金丝皇菊’的外植体消毒

外植体消毒是建立快繁技术体系的关键环节。‘金丝皇菊’茎段对5%和25%的次氯酸钠处理比较敏感，消毒浓度为25%时，组培苗的褐化率最高，染菌率最低。要想减少褐化现象的发生，消毒剂的浓度要在适宜的范围内。若消毒剂浓度过高，会直接杀死切口处的组织，导致整个外植体褐化。由于‘金丝皇菊’的茎段比较幼嫩，切口处易受到灭菌剂的伤害，褐化现象比较严重。所以外植体材料的消毒处理方式必须符合要求。

外植体灭菌前，先用流动的自来水冲洗，一般冲洗1~2 h。‘金丝皇菊’茎段及叶片表面长有小绒毛并不光滑，可加稀释后的洗洁精洗涤。虽然试验中选用茎段作为外植体，但是不宜将叶片连带叶柄全部摘下，否则一段时间后不仅外植体会萎蔫，经次氯酸钠处理伤口处的组织也会变白，丧失细胞活性（图4），所以需要预留一部分叶柄来保护茎段组织被消毒剂杀死（图5）。

图4 伤口处的组织在消毒后变白

图5 叶柄全部摘下（A）与叶柄部分保留（B）

试验发现，15%次氯酸钠消毒染菌率较低，组培苗长势最好，‘金丝皇菊’初代培养的最佳表面消毒条件为15%次氯酸钠消毒20 min。

顾昌华等[11]研究表明，用2%次氯酸纳+0.1%升汞消毒各5 min，对墨菊的外植体顶芽有良好的消毒效果。刘丹等[12]报道，盆栽小菊‘子午线’外植体最佳消毒处理方式是乙醇处理30 s，次氯酸钠溶液处理7 min。本研究结果与上述试验结果均有所不同。由此可见，菊花不同品种对消毒条件要求有所差异。

3.2 ‘金丝皇菊’的诱导培养

外植体的萌动受到启动培养基成分的影响。李露华[13]报道称，贡菊丛生芽最适合的诱导培养基为MS+6-BA1.5~2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1时有利于腋芽形成，45 d的增殖倍数为5.3~5.8。滕如萍等[14]指出，切花菊‘神马’顶芽初代再生的最适培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1。笔者在试验过程中发现，对于‘金丝皇菊’的茎段而言，随着6-BA浓度的增加，分化出的不定芽数量也逐步增加，诱导培养基的最佳激素配比为MS＋2.0 mg·L-16-BA＋0.3 mg·L-1NAA。本研究结果与以上结论有所不同，原因可能是品种和器官不同所致。

3.3 ‘金丝皇菊’的生根培养

试验发现，随着活性炭含量的增加，根的条数在增加，外观也更加粗长，这是因为在培养基中添加活性炭可以促进细胞分裂，吸附对生长有抑制作用的物质，并在生根培养阶段提供暗环境，更利于根的诱导和生长。随着植物生长调节剂浓度的升高，根萌发的条数在减少，由此证明了高浓度的植物生长调节剂会抑制根的分化，低浓度的植物生长调节剂促进根系的发生。本研究关于‘金丝皇菊’的生根培养试验结果表明，最佳生根培养基为1/2MS＋0.5 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA＋0.4%活性炭。接种28 d后平均生根数可达17条，生根率100%，优于汤春梅[15]的研究结果。

3.4 炼苗与移栽

炼苗时培养基水分蒸发较快，应及时观察以保证组培苗炼苗期间的成活率。本研究发现，炼苗时间为1.5 d左右较为合适，组培苗长势较好。移栽后根部损伤较轻的组培苗成活率和长势较高。

综上，本研究建立了‘金丝皇菊’组培快繁技术体系，为‘金丝皇菊’的规模化繁殖提供理论基础与技术支持。研究结果表明，‘金丝皇菊’的最佳消毒方案为15%次氯酸钠消毒20 min；诱导培养基的最佳配比为MS＋2.0 mg·L-16-BA＋0.3 mg·L-1NAA；生根培养基的最佳配比为1/2MS＋0.5 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA＋0.4%活性炭。