大蒜素及茜草素抗鸽毛滴虫药效观察

薛 勇，俞小红，徐嘉萍，王 洋

（苏州市畜牧兽医站，江苏 苏州 215128）

鸽毛滴虫病（Trichomonas gallinae）是一种单细胞原虫病，由鸽毛滴虫引起，主要侵害消化道上段，其主要特征是消化溃疡、下痢等[1]。毛滴虫病寄生于各种鸡、火鸡以及各野生的其他鸟类。成年鸽一般情况不出现临床症状，而青年鸽死亡数中有70%以上是由于在生长过程中感染毛滴虫引起的。幼鸽通常是因为尝食成年鸽嗉囊里的“鸽乳”而导致感染的，幼鸽由于免疫机制没有形成足够的保护力，从而受到强毒虫株的感染，导致死亡率高达50%。带虫幼鸽由于受到感染，不仅导致其营养吸收不良，肉质下降，而且还会成为新的感染源，感染其他幼鸽[2]。临床上治疗鸽毛滴虫的首选药物是具有明显杀毛滴虫效果的甲硝唑，但其具有较大的副作用，如致癌和人基因突变等[3]。另一方面，由于甲硝唑长期不正当的使用，毛滴虫对其耐药性日益显著，治愈率逐渐下降，并有一定的复发性[4]，同时使得药物残留也成为突出问题。虽然中草药没有一些西药见效快，但是由于中草药都是天然和毒副作用小的药物，因此，中草药越来越受到人们的青睐。抗毛滴虫中药种类多，包括白头翁、千里较光、大蒜素、茜草、五倍子等，对于其研究报道也较多[5]，但至今仍未见大蒜素抗鸽毛滴虫效果观察的报道。本试验选用大蒜素以及茜草素进行体外杀鸽毛滴虫的研究，结果如下。

1 材料与方法

1.1 试验虫株及病鸽的准备

鸽毛滴虫分离株，该虫株分离自六合区东沟镇养鸽场1月龄患病幼鸽，从其口腔中分离而得。3月龄感染毛滴虫白羽王鸽病鸽200只（南京市六合区东沟镇养鸽场提供）

1.2 试验药品及试剂

大蒜素（山东聚德药业有限公司，纯度＞25%），茜草素（南京泽朗医药公司，纯度＞50%），无水乙醇（分析纯AR，上海国药集团），蛋白胨（生化试剂，中国.天津布巴斯夫化工有限公司），麦芽糖（纯度＞98%），氯化钠（分析纯，西陇化工股份有限公司），L-半胱氨酸盐（纯度＞98%），青霉素（注射用青霉素钾，恒通兽药），链霉素（注射用硫酸链霉素，恒通兽药）。

1.3 主要试验仪器

FA1204B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司），BHC-13004A/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司），麦克奥迪SFC-100FL生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 大蒜素、茜草素体外抗鸽毛滴虫药效观察试验

（1）样品制备

取一定质量大蒜素、茜草素，分别配制成含有8mg/ml大蒜素原液、12mg/ml茜草素原液以及大蒜素-茜草素混合原液（包含8mg/ml大蒜素以及12mg/ml茜草素），置4℃冰箱保存备用。

（2）含药培养基制备

将已经配置好的8mg/ml大蒜素、12mg/ml茜草素溶液及大蒜素-茜草素混合液与肝浸汤培养液按倍比稀释，稀释倍数分别为1：1、1：2、1：4、1：8、1：16。

（3）虫体纯化与计数

取培养24h含有鸽毛滴虫培养液，将其在2000r/min的条件下离心10min，吸出上清液，丢弃，将1ml培养基加入沉淀中，反复吹打使其混匀，备用。用吸管吸取上述悬浮液20μl，置于380μl培养液中，稀释20倍。取稀释好的液体少许，滴入血球计数板计数，利用白细胞计数法进行计数（计上不计下，计左不计右，团体按单个计算），最终将鸽毛滴虫数用培养液调整为1×105个/ml，吸取0.2ml含虫液分别加入每个试管中，置于37℃恒温箱内培养。分别在2h、4h、8h、12h、24h时取样观察，计算鸽毛滴虫虫体死亡率。

（4）虫体死亡判断标准

虫体由梨形或者椭圆形变为圆形，边缘从光滑变为不正，轮廓模糊，虫体内含有数量不一的空泡，胞质内充满大量颗粒。虫体死亡率公式为死亡鸽毛滴虫数/观察总鸽毛滴虫数×100%。

（5）数据处理

采用SPSS软件对试验结果进行统计学分析。

1.4.2 大蒜素、茜草素体内抗鸽毛滴虫初步应用

（1）大蒜素-茜草素混合液准备

配制低、中、高三种不同浓度的大蒜素-茜草素混合液，备用。

（2）分组与给药

将感染毛滴虫病鸽随机分成4组，每组50只，分别标记为1、2、3、4。第一组喂低浓度混合液（40mg/ml），第二组饲喂中浓度混合液（60mg/ml），第三组饲喂高浓度混合液（100mg/ml），第四组为空白对照组。连续饲喂5d。

（3）数据处理

计算5d后鸽毛滴虫病治愈率。

2 结果与分析

2.1 大蒜素体外抗鸽毛滴虫药效观察

虫的平均杀虫率是100%，可见大蒜素最低有效杀虫浓度（MLCs）为0.5mg/ml。但随着药物浓度的增加，各试验组达到100%杀虫率所需时间大大减少。1：2浓度组（2mg/ml）杀虫率达100%只需4h，1：1浓度组（4mg/ml）所需时间更少，为2h。空白试验组杀虫率比较低，与大蒜素试验组比较有显著性（P＜0.05）。当药物浓度相同时，鸽毛滴虫死亡率随着时间的推移而逐渐增加（表1）。

表1 大蒜素体外抗鸽毛滴虫药效观察（n=3）

2.2 茜草素体外抗鸽毛滴虫药效观察

茜草素1：8浓度组，即0.75mg/ml在24h时对鸽毛滴虫的平均杀虫率是100%，得知茜草素杀灭鸽毛滴虫的最低有效杀虫浓度（MLCS）为0.75mg/ml。但随着药物浓度的增加，各试验组达到100%杀虫率所需时间大大减少。1：2浓度组（3mg/ml）杀虫率达100%只需4h，1：1浓度组（6mg/ml）所需时间更少，为2h。空白试验组杀虫率比较低，与大茜草素试验组比较有显著差异性（P＜0.05）。当药物浓度相同时，鸽毛滴虫死亡率随着时间的推移而逐渐增加（表2）。

表2 茜草素体外抗鸽毛滴虫药效观察（n=3）

2.3 大蒜素-茜草素混合液体外抗鸽毛滴虫药效观察

大蒜素-茜草素混合液在1：8浓度组时，能在24h内达到100%杀虫率；1：4浓度组时，4h即可将鸽毛滴虫杀虫率达到100%。1：1，1：2浓度组杀虫所需时间最短，都在2h内达到100%杀虫率。将大蒜素-茜草素混合液杀虫率与空白试验组比较，差异显著（P＜0.05）（表3）。

表3 大蒜素-茜草素体外抗鸽毛滴虫药效观察（n=3）

2.4 大蒜素-茜草素鸽场初步应用

大蒜素1：8浓度组，即0.5mg/ml在24h时对鸽毛滴

结果显示，中高浓度组、中浓度组感染率降低至10%以下，效果与甲硝唑组接近，而低浓度组降低至感染率达36%，空白组感染率依旧为100%。这表明，在使用了大蒜素、茜草素组合添加剂后，大大降低了毛滴虫的感染率，完全可以替代肉鸽养殖违禁药物甲硝唑（表4）。

表4 大蒜素-茜草素初步应用

3 讨论

本试验结果表明，无论大蒜素还是茜草素都具有明显的杀虫效果。大蒜素药物浓度在0.5mg/ml～4mg/ml时，具有明显抗毛滴虫作用，在上述药物浓度范围内，鸽毛滴虫的死亡率随着药物浓度增加以及作用时间延长而升高，大蒜素24h100%最低杀虫浓度为0.5mg/ml，4h完全杀虫浓度为2mg/ml。茜草素药物浓度在0.75～6mg/ml时，具有明显抗毛滴虫作用，在上述药物浓度范围内，鸽毛滴虫的死亡率随着药物浓度增加以及作用时间延长而升高，茜草素24h100%最低杀虫浓度为0.75mg/ml，4h完全杀虫浓度为3mg/ml。

通过组合试验表明，茜草素与大蒜素组合也能很好地抑杀鸽毛滴虫，且具有明显的协同作用。如大蒜素-茜草素混合液在比例为1：2时，2h杀虫率即可达到100%，而单独的大蒜素或者茜草素溶液在1：2时未能在2h完全杀死毛滴虫；再如，茜草素与大蒜素组合物在1：4的稀释度时，2h抑杀效果达到80%以上，4h后即可100%抑杀鸽毛滴虫，效果与单独使用1：2的大蒜素或茜草素的相似，甚至混合物稀释度至1：8时，至24h杀虫率仍然能达到100%。这些结果均证明了二者之间存在协同作用。但混合物的协同作用是以何种方式破坏毛滴虫的结构并最终杀死毛滴虫还有待于进一步研究。

在鸽场的初步应用中，大蒜素和茜草素具有明显的抑制鸽毛滴虫效果。高浓度与中浓度组治愈率均在90%以上，低浓度的治愈率也达64%，未用药组感染率达96%，说明在使用了大蒜素、茜草素组合后大大降低了鸽毛滴虫的感染率，从而可以替代违禁药物甲硝唑，为肉鸽标准化、无害化生产提供有效的方法。

近年来，肉鸽养殖业速度发展，但由于养殖技术的不足以及饲养环境、方式的不合理，导致鸽群中毛滴虫感染率一直处于较高位置并呈现逐年上升趋势。因此，这就导致抗生素以及抗鸽毛滴虫药物使用较为频繁。目前，在临床运用中抗毛滴虫药物主要有甲硝唑、替硝唑等硝唑类药物，虽然硝唑类药物具有十分明显的抗毛滴虫效果，但鸽毛滴虫耐药性显著增加，并且复发率有一定的提高，较大的副作用如致癌以及致基因突变也严重威胁人类健康[6]。大蒜素和茜草素作为防治鸽毛滴虫感染的新药，拥有绿色环保、毒副作用小等优越性，可作为硝唑类药物的替代药物，值得深入研究。