HPLC法测定蒙药蓝刺头中7种有机酸的含量

赵磊，姜大成，王丹彧，马彧※，王路宏※

（1.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000）

蓝刺头为菊科蓝刺头属植物蓝刺头（Echinops latifolius Tausch.）的干燥头状花序，收录于《卫生部药品标准蒙药分册》中，蒙语称作“扎日阿乌拉”，具有固骨质、接骨愈伤和清热止痛的功效，用于骨折、骨热、刺痛症及疮疡等疾病[1]，分布于我国东北、内蒙古、甘肃、宁夏、河北、山西及陕西[2]，生于海拔120~2 200 m的山坡草地及山坡疏林下。据文献报道蓝刺头中含有有机酸、黄酮和苯丙素类等化学成分[3-9]，其中有机酸类作为一种重要的生物活性物质，具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、保肝利胆、降血压和降血脂等作用，是蓝刺头药材中重要的药效物质。现行《卫生部药品标准蒙药分册》标准蓝刺头项下缺少含量测定项目，仅有一些文献报道。李岩等[11]采用HPLC法测定蓝刺头及其制剂中芹菜素-7-O-葡萄糖的含量；周容等[12]采用HPLC法测定了新疆蓝刺头花乙醇提取物中芦丁的含量，但尚未有学者对其有机酸含量测定方法进行深入研究。本研究建立蓝刺头中的7个有机酸类成分测定方法，简便、可靠，为建立蓝刺头多指标质控标准提供科学依据。

1 仪器、试药

1.1 仪器

1260型液相色谱仪配DAD检测器（Agilent公司）；BT125D型电子天平（上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造）；2001B型系列超纯水器（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-500DV型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

绿原酸（批号110753-202119，含量以96.3%计）、咖啡酸（批号110885-201703，含量为99.7%）、芦丁（批号100080-202012，供HPLC法测定，含量为91.6%）、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号111782-201807，含量以94.3%计）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（批号111894-202104，含量以95.1%计）由中国食品药品检定研究院提供；5-咖啡酰奎尼酸（批号MUST-16022403，含量大于98.0%）、3,4-二咖啡酰奎尼酸（批号MUST-16031612，含量大于98.0%）由成都曼斯特生物科技有限公司提供。水为纯化水；三氟乙酸、乙腈、甲醇均为色谱纯。收集到10批蓝刺头药材，样品经四平市食品药品检验所赵磊主任药师鉴定为菊科蓝刺头属植物蓝刺头Echinops latifolius Tausch.的干燥头状花序，规定批号为LCT1~LCT10，见表1。

表1 蓝刺头样品信息来源Table 1 Echinops latifolius sample source information

2 溶液的配置

2.1 混标对照品配置

精密称取5-咖啡酰奎尼酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品分别置于100 mL量瓶中，采用甲醇摇匀溶解，分别配制成质量浓度为101.1g/mL、102.6g/mL、96.1g/mL、94.5g/mL、96.1g/mL、100.3g/mL、95.5g/mL的7种成分对照品储备液。分别精密吸取上述对照品溶液10mL、5mL、5mL、5mL、5 mL、20 mL、10 mL置同一个100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释成为10.11g/mL、5.13g/mL、4.80g/mL、4.72g/mL、4.80g/mL、20.06g/mL、9.55g/mL的混标对照品溶液，摇匀，即得。

2.2 样品溶液制备

精密称定蓝刺头粉末0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放置室温后再称定重量，采用50%甲醇补足蒸发的重量，混匀后过滤，用0.45m微孔滤膜滤过，即得。

3 色谱条件

流动相为乙腈（A）-0.08%三氟乙酸水溶液（B），进样量为10L，流速为1.0 mL/min，检测波长为325 nm。色谱柱为Waters HSS T3 C18（4.6 mm 250 mm,5m）。梯度洗脱见表2。

表2 蓝刺头7种成分测定梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure for the determination of seven components of Echinops latifolius sample

4 测定法

图1 蓝刺头中7种成分的色谱图Fig.1 HPLC of 7 Components in Echinops latifolius

5 系统适用性试验

5.1 线性关系考察及检测限与定量限

精密吸取各对照品储备液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、1 mL、2.0 mL和5.0 mL分别置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度作为混标溶液。分别精密吸取各系列浓度混标溶液及对照品储备液各10L测定，分别以7种对照品的质量浓度（g/mL）为横坐标，采用峰面积为纵坐标，得到线性方程。稀释对照品溶液后进样测定，当信噪比为3时测定检测限，当信噪比为10时测定定量限。检测结果见表3。

表3 7种测定成分的标准曲线方程、线性范围、相关系数及检出限与定量限Table 3 Standard curve equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 7 determined components

5.2 精密度考察

5.3 重复性考察

取样品粉末（LCT1样品）6份，分别按照供试品溶液制备方法制备，按照色谱方法测定，计算含量。结果各份供试品溶液的5-咖啡酰奎尼酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸的测定结果RSD（n=6）分别在1.38%~1.96%，结果表明重复性良好。

5.4 稳定性考察

取同一供试品溶液（LCT1样品溶液），分别于0h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h进样测定。结果5-咖啡酰奎尼酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸的峰面积的RSD（n=6）分别在0.68%~1.13%，结果表明样品溶液在24 h内稳定。

5.5 回收率考察

取已知含量得蓝刺头样品（LCT1样品）粉末6份，每份约0.15 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入近等量得各对照品溶液，分别按照供试品溶液方法制备，按色谱方法测定，计算回收率，结果5-咖啡酰奎尼酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸平均加样回收率（n=6）分别在97.89%~99.67%，RSD分别在1.54%~2.11%，表明回收率良好。

5.6 蓝刺头7种成分含量测定

测定LCT1~LCT10批样品，分别按供试品溶液制备方法制备。精密吸取各供试品溶液10L，按上述色谱条件进行测定，采用外标法计算百分含量，结果见表4。

表4 蓝刺头中7种成分含量测定结果Table 4 Content determination results of 7 components in Echinops latifolius %

6 讨论

6.1 色谱条件的选择

采用高效液相色谱法测定蓝刺头中的7种主要化学成分，5-咖啡酰奎尼酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸分离度良好，50 min完成测定，结合文献查询，结果采用325 nm时7种化学成分均有较大吸收，杂质峰干扰较少，故采用325 nm波长进行检测。流动相经多种流动相体系测定，结果显示乙腈-0.08%三氟乙酸为流动相分离效果好，色谱峰理论板数较高，峰形对称。

6.2 含量测定

本实验在同一色谱条件下，同时测定不同批次蓝刺头中绿原酸、4-咖啡酰奎尼酸、咖啡酸、芦丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸7种有效成分的含量，方法简便、快速、准确，为有效控制蓝刺头的质量提供了科学依据。测定的10批药材中绿原酸与3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量结果差异较大，可能因为样本与产地、采收期及储存时间都有密切的关系，并且绿原酸和咖啡酰基成分也不太稳定。