二苯乙烯苷含量为指标的古方固发喷雾提取工艺研究

谷昕雨，王欣媛，潘美红，任堂君，于蕾

（哈尔滨商业大学英才学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

古方固发喷雾是由哈尔滨商业大学古方固发项目团队自主研发的适用于白发脱发老年群体的护理保健品。随着年龄的增长，头发逐渐灰白、脱落。当今时代，老年人群对于头发的保养护理逐渐重视，脱发白发问题急需解决。在以往对于白发的相关研究中得出氧化应激是头发变白的起始和进展的关键机制，检测到中药何首乌提取物具有保护黑色素细胞活性免受氧化应激的能力[1]。在脱发方向的医学研究领域中，何首乌的抗脱发作用已被广泛认可。有研究数据表明，何首乌中的有效成分二苯乙烯苷具有良好的促毛发再生的作用，其机制可能与抑制p53、Fas和Bax诱导的细胞凋亡有关[2]。基于何首乌在乌发固发方面研究的有效成果，本项目确定将喷雾古方选用中国传统药材何首乌、生地黄、侧柏叶和黑芝麻梗，每味药材的配比严格按照古方《中医临床备要·基本篇》[3]。其中君药何首乌具有补益精血、乌发固发、强健筋骨和补肝肾等功效[4]。基于社会老年群体白发脱发的困扰，本项目组展开古方固发喷雾的产品研发。以二苯乙烯苷含量为评价指标，旨在根据古方的特性和功效优化喷雾的提取工艺，以期将古方固发喷雾加工成安全、规范、合理、有效的现代防脱固发、乌发类产品。

1 实验材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱系统（Waters公司2695）；色谱柱（Agela Technologies公司Venusil XBP C18，250 mm 4.6 mm，5m）；旋转蒸发仪（爱朗仪器有限公司N-1100）；水浴锅（爱朗仪器有限公司GSH-2100）；电子天平（艾德姆衡器有限公司NBL 214）。

1.2 实验材料

何首乌Polygonum multiflorum Thunb.（北京同仁堂）；生地黄Rehmannia glutinosa Libosch.（北京同仁堂）；侧柏叶PLatycladus orientalis（L.）Franco.（人民同泰医药）；黑芝麻梗，为脂麻Sesamum indicum L.的干燥梗。二苯乙烯苷（含99.8%2,3,5,4” -四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷）标准品（大连美仑科技有限公司）；乙醇（分析纯），蒸馏水，甲醇（色谱纯）（A456-5）（天津格里斯医药化学技术有限公司），乙腈（色谱纯）（A955-4）（天津益仁达化工有限公司）。

2 实验方法与结果[5-9]

2.1 溶液的配制

2.1.1 标准品溶液配制称取二苯乙烯苷对照品0.1 mg，用色谱甲醇进行溶解并定容到1 mL棕色容量瓶中，密封储存备用。

2.1.2 供试品溶液配制称取何首乌3 g、生地黄3 g、侧柏叶5 g、黑芝麻杆5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，以料液比（重量体积比）1:10加入65%稀乙醇溶液，加热回流1 h。后将所得的初步样品液旋蒸至黏稠状态并挥至无醇味。水浴加热将样品液制成浸膏状态，称量浸膏的重量并记录数值，取0.05 g浸膏定容至5 mL容量瓶中，密封储存备用。

2.1.3 阴性样品溶液配制取除何首乌外的其余药材参照“2.1.2”的方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

2.3 专属性考察

图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of standard

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of the test sample

图3 阴性样品色谱图Fig.3 Negative sample chromatogram

2.4 线性关系考察

2.5 精密度试验

2.6 重复性考察

取“2.1.1”制备的对照品溶液共6份，按照“2.2”的色谱条件连续进样，测定二苯乙烯苷峰面积。RSD=1.35%＜2%，该数据可表明实验方法的重复性良好。

2.7 加样回收率考察

按照“2.1.2”中方法平行配制6份已知含量的供试品溶液，分别加入二苯乙烯苷对照品适量，按照“2.2”的色谱条件各进样5L，测定二苯乙烯苷峰面积，计算加样回收率。结果见表1，最终所得数据表明实验方法的准确性良好。

表1 二苯乙烯苷加样回收率考察Table 1 Investigation of the spiked recovery of the stilbene glucoside

2.8 单因素试验设计

2.8.1 乙醇浓度的影响将处方的药材按照比例缩小10倍，称取何首乌3 g、生地黄3 g、侧柏叶5 g、黑芝麻梗5 g，置于圆底烧瓶中。分别配制45%、55%、65%、75%、85%的乙醇，连接回流装置，以料液比（重量体积比）1:10加入乙醇，回流1 h后，静置，稍冷，过滤，用旋转蒸发仪加热浓缩，得浸膏。称取0.01 g浸膏，加甲醇定容至5 mL，用高效液相色谱系统测定二苯乙烯苷含量。以二苯乙烯苷含量为纵坐标，乙醇浓度为横坐标，绘制曲线，见图4。

图4 乙醇浓度对二苯乙烯苷含量的变化趋势Fig.4 Trends of ethanol concentration on the content of stilbene glycosides

以上结果表明，在乙醇浓度为55%的条件下，提取物中二苯乙烯苷含量较高。

2.8.2 提取时间的影响 将处方的药材按照比例缩小10倍，准确称取何首乌3 g、生地黄3 g、侧柏叶5 g、黑芝麻梗5 g，置于圆底烧瓶中。连接回流装置，以料液比（重量体积比）1:10加入65%的乙醇，分别回流1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h。静置，稍冷，过滤，用旋转蒸发仪加热浓缩，得浸膏。称取0.01 g浸膏，加甲醇定容至5 mL，用高效液相色谱系统测定二苯乙烯苷含量。以二苯乙烯苷含量为纵坐标，提取时间为横坐标，绘制曲线见图5。

图5 提取时间对二苯乙烯苷含量的变化趋势Fig.5 Trends of extraction time on the content of stilbene glycosides

以上结果表明，在加热回流3 h的条件下，提取物中二苯乙烯苷含量较高。

2.8.3 料液比（重量体积比）的影响将处方的药材按照比例缩小10倍，准确称取何首乌3g、生地黄3g、侧柏叶5 g、黑芝麻梗5 g，置于圆底烧瓶中。连接回流装置，分别以1:5、1:10、1:15、1:20、1:25的料液比（重量体积比）加入65%的乙醇，回流1 h后，静置，稍冷，过滤，用旋转蒸发仪加热浓缩，做成浸膏。精密称取0.01 g浸膏，加甲醇定容至5 mL，用高效液相色谱系统测定二苯乙烯苷含量。以二苯乙烯苷含量为纵坐标，乙醇用量为横坐标，绘制曲线见图6。

图6 料液比（重量体积比）对二苯乙烯苷含量的变化趋势Fig.6 Trends of material-liquid ratio(weight to volume ratio)on the content of stilbene glycosides

以上结果表明，在料液比（重量体积比）1:10的条件下，提取物中二苯乙烯苷含量最高。

2.9 正交试验

为进一步分析各因素对提取结果的影响，优化提取工艺，则需要进行正交实验[10,11]。在单因素的基础上，采用L9(33)正交实验，以乙醇浓度（A）、提取时间（B）和料液比（重量体积比）（C）作为考察因素，每个因素选择3个水平进行实验，各因素水平表见表2，D列设置为空白对照，以二苯乙烯苷含量为评价指标，对实验结果进行直观分析和误差分析，实验结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4分析可得，因素A、B、C对结果均有显著影响，且各单因素对二苯乙烯苷含量的影响程度由大到小依次为A＞C＞B，即乙醇浓度对其影响最大，料液比（重量体积比）和提取时间次之。综合分析结果，从降低成本可得最佳提取条件为A2B3C1，即5倍量浓度为55%的乙醇，回流提取2.5 h。

2.10 验证实验

称取何首乌3 g、生地黄3 g、侧柏叶5 g、黑芝麻梗5 g，按照正交实验所得最佳提取条件平行实验3次，所得二苯乙烯苷含量平均值为14.2 mg/g。结果表明，与正交实验结果相近，所优化的提取工艺基本稳定，具有可操作性，可作为古方固发喷雾的最佳提取工艺。

3 讨论

古方固发喷雾研发利用现代的提取工艺使古方重获新的生命，增强乌发、固发效果。何首乌作为古方中的君药，据《本草纲目》记载，其性质温和，味道稍有苦涩，能够滋补肝脏和肾脏，收敛精气，故而可补精补血、乌发固发。现代医学研究证实，二苯乙烯苷为何首乌的主要药效成分[12,13]，故选择二苯乙烯苷含量作为提取工艺考量指标，优化提取工艺。

本研究经严谨的方法学考察建立准确合理的高效液相色谱系统分析方法。流动相条件选择乙腈水（20:80）将二苯乙烯苷的分析时间控制在20 min以内，合理提高实验效率。回归方程R2=0.999 1，显示在设计范围内二苯乙烯苷含量测定结果与供试品中被测成分浓度呈现良好的线性关系。该方法考察项均在规定标准范围内，平均加样回收率高达98.8%，标准偏差仅0.66%。为进一步提高提取效率，研究中分析提取时间、乙醇浓度、乙醇用量3个单因素对提取效率的影响，减小极差，绘制二苯乙烯苷含量折线图。根据图表变化趋势，选取合理的正交试验范围，进而设计因素水平表以及3因素3水平正交表考量各因素的综合作用对于二苯乙烯苷提取效率的影响程度[14]。分析显示，乙醇浓度对提取效率影响程度最大，料液比（重量体积比）和提取时间次之。从降低成本、节约时间的角度考虑，最终确定在乙醇浓度为55%、料液比（重量体积比）为1:5、提取时间为2.5 h的条件下获得最高提取效率。此时二苯乙烯苷浓度达到14.2 mg/g，浓度保持在较高水平，产品质量稳定、有效[15]。

喷雾制剂提取工艺将会直接影响产品的质量与疗效。本研究中，古方固发喷雾提取工艺科学、合理、效率高及重复性好，按照原始古方的配伍方法，合理改良方剂，保证其药效发挥，有效延缓头发变白，减少脱发症状。未来利用新型透皮吸收促进剂作缓释控释研究，结合现代的药理学研究成果，进一步提高作用效果和给药效率，并逐步揭示古方固发喷雾的作用机理，这将会给中药固发喷雾的应用和开发带来质的飞跃。