GA3处理下葡萄果形变化及其生理和分子机制

刘 静， 董 阳， 农慧兰， 余 欣， 黄丽媛， 郑 焕， 陶建敏

(南京农业大学园艺学院，江苏南京 210095)

葡萄是葡萄科葡萄属落叶果树作物，在世界范围内广泛种植，其栽培历史有6 000～7 000年[1]。在我国，葡萄是深受人们喜爱的水果之一，是一种较为畅销的水果种类，具有较高的经济价值。葡萄在我国果树生产中占有至关重要的地位，是加工深度最高和加工产品最丰富的水果之一[2]，其不仅可用于鲜食，还可用于制干、制汁、制醋、酿酒等。近些年来，中国葡萄的种植，无论是栽培面积，还是产量以及品质方面，发展都非常迅猛，中国已成为世界葡萄生产大国[3]。

葡萄果实形状是葡萄重要的外观品质，被认为是育种的主要选择标准之一。根据葡萄果形特性，可将葡萄果粒形状分为不同的类型，如指形、圆形、卵形、束腰形、弯形等[4-5]。由于消费者喜好不同，果实形状在很大程度上影响人们对于葡萄品种的选择。人们会依据果实的大小和形状来评判其产量、质量以及营养价值等重要的经济性状。果实形状通常用果形指数(果实纵径与果实横径的比值)进行表示[6]。随着社会的发展，人们的消费习惯也发生了改变，人们越来越不满足于当前常规的水果果形，在满足果实内在品质的同时，人们逐渐开始追求一些新奇、独特的髙品质水果产品。葡萄的果实形状在一定程度上影响了葡萄的经济价值及人们的消费选择[7]。因此，对葡萄果形的研究越来越有必要。

植物激素对果实的生长发育具有重要作用。从花到果的转变过程中，植物激素如生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素等起到了关键作用[8-9]。赤霉素是植物五大激素之一，参与植物许多生长发育过程，例如开花和坐果[10-11]，生长素和赤霉素都是果实发育所需的主要激素[12]。GA3由于具有提高坐果、增大果实和提高品质等方面的作用而被广泛应用于果树生产实践中。研究表明，GA3对果实生长发育的影响主要是通过促进植物细胞分裂和伸长而实现的[13]。此外，GA3处理后能增加生长素的含量，GA3对生长素的调节机制可能是GA3通过促进蛋白质的降解，提高色氨酸的含量，进而促进生长素的合成；并且GA3也可能通过调节结合态生长素转化为游离态生长素、抑制生长素氧化酶来影响生长素水平[14]。一方面，GA3有调运、吸引营养物质的作用，对果实形状建成也具有一定的影响[15]，另一方面，GA3还可以对生长素的含量进行调节，说明GA3对果实的生长发育具有显著的影响[16-17]。

目前已经有研究表明GA3对于葡萄果形具有显著的调节作用，Dokoozlian等发现GA3的施用可以增加葡萄果实长度[18]；Casanova等在研究中进一步阐述了GA3对葡萄果实形状的影响主要是通过改变葡萄果实细胞形态而实现的，GA3不影响果实果皮细胞数，但增加果皮细胞直径[19]；通过施用赤霉素生长抑制剂如2-氯乙基三甲基氯化铵(CCC)，还可以通过抑制赤霉素的合成，从而使果实变小[20]；此外，在其他物种上也有许多GA3对果形具有显著调节作用的实例，在Chen等的研究中分别对番茄施用GA3和赤霉素抑制剂PAC，结果表明，GA3处理的番茄果实果形指数为1.25，显著高于对照(1.09)，施用PAC使果形指数降至0.87，说明GA3可以显著提高番茄果形指数[21]；Wang等在草莓中发现了一种短果形的突变体sf，其研究推测该突变体可能是由于GA3合成途径的缺乏而导致的[22]。Ahmed等研究发现，在枣树上施用GA3，可以增加果长和果径[23]。总之，大量研究结果表明，GA3在调控果实形状方面具有重要的作用。但现有的研究大多是研究外施GA3对果实外部特征的影响，深入到分子层面上进行探究的研究相对较少，目前对GA3调控果形变化的内部分子机制研究还相对空白。本研究旨在探究GA3对果形影响的内部分子机制，挖掘其潜在的调控基因，为葡萄果实形状调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及其处理方法

试验于2020年在南京农业大学汤山葡萄试验基地进行，以金手指葡萄为试验材料。采用平棚架避雨栽培，株行距为3.0 m×6.0 m。土肥水管理及病虫害防治同常规管理。以花序穗肩的第1个小穗上50%的小花开放为盛花期。于盛花后3 d，选取3株树势健壮且相近的金手指葡萄植株，使用25 mg/L GA3溶液对幼果进行处理，每个处理选取60穗左右，并做好标记，以清水作为对照。分别于处理后 6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d、14 d采集处理及对照的幼果。处理后7、14 d的样品置于FAA固定液中，4 ℃保存，用于后续石蜡切片的制作；处理后 6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d的样品立即用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中，用于后续总RNA的提取，其中，部分处理后48 h、4 d的样品用于后续内源GA3、生长素和IAA-ASP含量的测定。

1.2 成熟期葡萄表型观察

以处理组(T)和对照组(CK)在成熟期的果实为样品。测量样品的纵径和横径并计算果形指数，处理组及对照组均含有20个样品。

1.3 果实细胞的形态观察

以处理组和对照组在7、14 d时采集的果实为样品制作成石蜡切片。样品采集之后立即放在FAA固定液中进行固定，并置于4 ℃下进行保存。样品以乙醇/二甲苯系列脱水，石蜡包埋，切成3 μm厚的切片，干燥后用甲苯胺蓝进行染色。采用正置荧光显微镜显微成像系统观察细胞形态，测量细胞的纵径和横径并计算细胞指数(细胞纵径与细胞横径的比值)，每次测量使用来自3个不同样品的3个切片[24]。

1.4 内源GA3、生长素和IAA-ASP含量的测定

以处理组和对照组在48 h和4 d时采集的果实为样品，采用高效液相色谱电喷雾串联质谱法(ESI-HPLC-MS/MS)测定样品内源GA3、IAA和IAA-ASP的含量。样品洗净后在液氮中研磨成粉末，称取0.5 g样品粉末，加入4 mL提取缓冲液(柠檬酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和甲醇)。4 ℃振荡过夜后，10 000g离心15 min，取出上清液。沉淀反复浸提2次，合并所得上清液。在4 ℃摇动 1 h，转速为120 r/min，10 000g离心15 min。然后将上清液在氮气下干燥，300 μL甲醇(0.1%甲烷酸)复溶，并通过0.22 μm的滤膜。色谱条件：采用poroshell 120 SB-C18反相色谱柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)，进样量为2 μL。质谱条件：喷雾电压 4 500 V，气幕、雾化器和辅助气体压力分别为15、65、70 psi。雾化温度为400 ℃，进行3次独立的生物重复试验[24]。

1.5 葡萄果实总RNA的提取

以处理组和对照组在6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d时采集的果实为样品，进行总RNA提取，总RNA的提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按照说明书进行操作。取2 μL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，对RNA样品的质量进行检测。用Nanodrop ND-1000分光光度计检测RNA浓度。

1.6 荧光定量PCR

采用Q5荧光定量仪进行qRT-PCR分析。使用snapgene软件设计引物，引物见表1。所有引物均使用PCR扩增、电泳以及溶解曲线进行测试，以保证引物特异性。以VvUbiquitin作为内参基因，反应体系按SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)试剂盒说明书进行操作，进行3个生物学重复试验，使用2-ΔΔCT公式计算相对表达量[25]。

表1 荧光引物设计序列

1.7 统计分析

用Excel 2010和SPSS 17.0进行统计分析，Adobe Photoshop CC 2019作图，SPSS进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 GA3处理葡萄成熟期果实形态观察

如图1所示，金手指葡萄果实成熟后，使用GA3处理的金手指葡萄外观出现了明显的变化：GA3处理的葡萄果形伸长，串型较对照组更为松散，且处理组葡萄果穗变长(图1-A)；果粒形状较对照组明显拉长(图1-B)，处理组果粒的纵径为 40.31 mm，显著大于对照组(28.2 mm)(图1-C)，但果粒的横径无显著差异(图1-D)。计算果形指数可知，处理组果形指数为2.58，显著高于对照组(1.81)(图1-E)。结果表明，适当GA3处理可以显著拉长葡萄果实，增加葡萄果形指数。此外，GA3处理对葡萄果穗也具有一定的拉长作用。

2.2 GA3处理葡萄果实组织学观察

为进一步观察GA3处理对细胞发育的影响，以处理后7、14 d的金手指葡萄果实为样品制备石蜡切片。观察发现，GA3处理的葡萄果实细胞明显大于对照组，且处理组细胞较对照组明显拉长(图2-A、2-B)；相同的视野内处理组所能看到的细胞数明显少于对照组，说明处理后葡萄果实内部细胞面积增大(图2-A、图2-B)。细胞纵横径测量结果显示，处理后7 d，处理组细胞平均纵径为 49.02 μm，对照组为 32.87 μm；处理后14 d，处理组细胞平均纵径 121.88 μm，对照组为56.98 μm、处理后7、14 d的金手指葡萄果实细胞纵径均显著变大，其中处理后14 d细胞纵径变化更大，但细胞横径变化均不显著。经计算细胞指数可知，处理后7 d，处理组细胞指数为2.38，对照组为1.67；处理后14 d，处理组细胞指数为2.70，对照组为1.48，细胞指数均显著增大。这些结果表明，GA3在果实发育早期通过促进细胞膨胀和细胞伸长来增大果实，从而起到拉长葡萄果实的效果。

2.3 GA3处理对金手指葡萄果实中内源赤霉素、生长素和IAA-ASP含量水平的影响

通过ESI-HPLC-MS/MS方法测定GA3处理组和清水对照组样品中内源赤霉素(GA3)、生长素(IAA)以及IAA-天冬氨酸(IAA-ASP)的含量。结果表明，GA3处理48 h、4 d后，处理组葡萄果实中内源赤霉素含量分别为对照组的4.2、4.3倍(图 3-A)；GA3处理48 h后，葡萄果实中IAA和IAA-ASP含量开始较对照组升高，且处理后4 d处理组IAA和IAA-ASP含量与对照组之间的差异显著增大，处理组分别为对照组的2.7、18.4倍(图3-B、图3-C)。说明外源GA3处理会使金手指葡萄果实中的内源赤霉素、IAA和IAA-ASP含量升高。

2.4 GA3处理对金手指葡萄果实中生长素生物合成和信号转导相关基因表达模式变化的影响

为了进一步探究生长素对果实形状的影响，本研究测定了葡萄果实中生长素生物合成和信号转导相关基因的表达。YUCCA是生长素合成过程中的关键基因，挑选3个YUCCA基因家族的成员VvYUCCA2、VvYUCCA6-1及VvYUCCA6-2进行qRT-PCR检验。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，金手指葡萄中生长素合成相关基因VvYUCCA表达量呈升高趋势，在处理后24 h时达到最高且与对照组含量差异最大。3个基因表达趋势较为一致。GA3处理后24 h时，金手指葡萄中VvYUCCA2、VvYUCCA6-1表达量为对照组的4～5倍，并随着时间的推移，处理组与对照组之间的差异逐渐减小，表明GA3处理可能会提高金手指葡萄中VvYUCCA2、VvYUCCA6-1及VvYUCCA6-2基因的表达水平，从而提高生长素的含量(图4-A、图4-B、图4-C)。IAA1是生长素/吲哚-3-乙酸基因家族成员，是一种生长素信号转录调控基因，与对照组相比，VvIAA1在处理6 h后表达量无明显差异，在处理12 h～7d后，表达水平显著升高。说明GA3处理会影响金手指葡萄中的生长素信号转导(图 4-D)。AUX22A和AUX22D是2个生长素响应基因，GA3处理后VvAUX22A表达量较对照组呈升高的趋势，然而VvAUX22D表达量却表现出先下降后升高的趋势，但整体上GA3处理会显著上调VvAUX22A和VvAUX22D基因的表达。VvAUX22A和VvAUX22D处理组表达量与对照组差异最大的时期都为处理后24 h，此趋势与3个VvYUCCA基因的表达一致(图4-E、图4-F)。

3 讨论

葡萄果形是葡萄重要的外观品质，生产上常用各种植物生长调节剂对葡萄果实形状进行调节。GA3常在生产上被用于果实品质的调节，是一种应用较为广泛的植物生长调节剂。但其具体作用机制现在还不明晰，本研究以此为出发点，选择长形葡萄品种金手指为试验材料，探究GA3对葡萄果形的影响。结果表明，在盛花期后3 d施用GA3可以显著拉长金手指葡萄果粒，这与谢周等的研究结果[26]一致。同时，葡萄果穗也有一定程度的拉长，葡萄整体串形更为松散，果粒生长空间大，更适于葡萄生长，这与李蕊蕊等的研究结果[27]一致。依据试验结果推测，GA3的拉长作用可能不仅限于果实，它对其他植物器官可能也具有拉长作用，并可能通过改变植物组织的内部细胞结构而发挥作用。

GA3已被证实具有促进细胞伸长的作用[28]，但其对葡萄果实的拉长作用是否是通过促进果实内部细胞伸长而实现尚不清楚。因此，本研究选择GA3处理后7、14 d的果实为样品制作石蜡切片，观察果实内部细胞形态，测量细胞纵径、横径并计算细胞指数。结果表明，处理组果实内部细胞确实较对照组大且长；细胞纵横径及细胞指数规律进一步验证了“果实细胞显著伸长”这一结论，据此可初步验证GA3对金手指葡萄果形的影响是通过改变细胞形状而实现的。植物激素共同作用于植物器官生长[29]，赤霉素可能会通过与其他激素共同作用来促进葡萄果实伸长，生长素是与果实发育息息相关的植物激素[30]，IAA-ASP是生长素的主要储存形式[31]。本研究利用ESI-HPLC-MS/MS方法测定了金手指葡萄果实中的内源赤霉素、生长素和 IAA-ASP 含量。结果表明，GA3处理可以提高果实内源赤霉素、生长素及IAA-ASP含量，这与前人的研究结果[32-33]相近，推测GA3作用于金手指葡萄果实后可能会引起果实内源激素的变化，从而调节果形变化。此外，GA3处理48 h后IAA和IAA-ASP含量差异较小，但处理后4 d的IAA和IAA-ASP含量较对照组差异极显著，据此推测GA3对IAA和IAA-ASP含量的促进作用可能是在处理后48 h这段时间内逐渐发生的。

YUCCA作为生长素合成过程中的关键基因，YUCCA基因的激活或者过表达都会导致游离的生长素含量升高，且YUCCA基因家族多功能冗余，可能需多个基因协同发挥作用[34]。本研究中选择3个YUCCA基因家族的基因进行qRT-PCR验证，结果表明3个基因家族表达趋势基本一致，说明这3个基因可共同作用于生长素的合成。推测GA3处理可以通过提高YUCCA基因表达水平来提高游离态IAA的含量，从而促进果实伸长。处理组与对照组中YUCCA基因的含量及含量差异均在24 h处达到最高值，推测GA3对果实伸长的促进作用可能主要发生在处理后12～48 h之间。根据IAA1的表达趋势也可以推测GA3处理可能通过影响上游生长素信号转导物质的含量来调控果形变化。通过 qRT-PCR 技术对2个生长素响应基因AUX22A和AUX22D的验证推测GA3处理也可能通过影响下游生长素响应基因的表达来调控果形变化。此外，GA3处理后VvAUX22A表达量较对照组呈升高的趋势，但VvAUX22D表达量却表现出先下降后升高的趋势，然而整体趋势与VvAUX22A相似，推测2种响应基因之间可能存在着先后关系。

4 结论

在金手指葡萄盛花期后3 d，使用25 mg/L GA3溶液浸泡幼果，可显著拉长葡萄果实，同时果实内部细胞发生膨大且细胞指数变大。外源赤霉素处理可能通过调节葡萄果实中内源生长素的合成和信号转导途径来影响葡萄果实形状。