基于网络药理学和生物信息学探究桑叶-桑寄生治疗糖尿病肾病的机制Δ

李 旦，江渊远，黄晨曦，刘城圣，范 伟，薛 松，吴国庆#

(1.江西中医药大学研究生院，南昌330006； 2.江西中医药大学附属医院肾病科/江西省中医药重点研究室-慢性肾衰病重点研究室，南昌330006)

糖尿病在全球的发病率逐年升高，据估计，全世界超过8%的人(约4.5 亿人)患有糖尿病，预计到2045年，这一数字将增长到超过7亿人，超过40%的糖尿病患者将有可能发展为慢性肾脏病[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见和最严重的并发症[2]。桑叶-桑寄生是国医大师皮持衡治疗DN的常用药对，随证加减，在临床上取得了较好的疗效[3]。网络药理学是近年来中医药研究的常用方法。基因表达数据库(GEO)是美国国立生物信息技术中心(NCBI)于21世纪初研发的目前世界上存储高通量基因表达数据最全面的开源数据库[4]。目前，网络药理学研究大多基于治疗靶点数据库如人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)、GeneCards数据库和DrugBank数据库等对疾病靶点进行预测，上述方法获得的靶点信息更加海量，但相比之下，通过对GEO数据库中真实临床样本基因芯片数据的差异表达基因筛选能够更加可靠、准确、高效地反映疾病本质特征和规律[5]。故本研究联合运用网络药理学和生物信息学方法，探究桑叶-桑寄生治疗DN的潜在机制，以期更好地传承名老中医经验，为临床用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 桑叶-桑寄生有效成分及靶点的获取

以类药性(DL)≥0.18，口服生物利用度(OB)≥30%为标准，从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http:∥tcm-spw.com/tcmsp.php)获取桑叶、桑寄生的有效成分，并获取其对应的靶点[6]。在Uniport数据库对靶点进行注释。

1.2 DN相关靶点的获取

在GeneCards数据库(https://www.gencards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、DrugBank数据库(https://go.drugbankcom/)和PharmGKB数据库(https://www.pharmgkb.org/)中获取DN的相关靶点。将桑叶-桑寄生有效成分靶点与DN相关基因取交集，并在微生信在线软件作图工具平台(http:∥ bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图。

1.3 药物-成分-靶点-疾病关系网络的构建

利用WPS Office软件、Cytoscape 3.9.0软件构建有效成分、靶点、疾病之间的关系网络。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建

利用STRING数据库(https://string db.org/cgi/input.pl)构建交集基因的PPI网络，并利用Cytoscape 3.9.0软件的Cyto NCA、NetworkAnalyzer插件筛选出PPI网络中的核心靶点。

1.5 DN基因表达谱及差异基因的获取

在GEO数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“Diabetic Nephropathy”为关键词，将物种设置为“homo sapiens”，搜索相关的矩阵文件。利用R语言对数据集注释、分类，limma包分析差异基因，并绘制热图及火山图。

1.6 共同靶点及差异基因富集分析

运用R 4.0.3 软件，引用clusterProfiler、enrichplot和ggplot2包，对共同靶点及差异基因进行基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，并绘制柱状图和气泡图。比较二者富集的通路并筛选出交集通路，其可能为桑叶-桑寄生药治疗DN的关键通路。

1.7 分子对接

通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得活性成分sdf格式化学结构，在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中获取核心靶点对应的大分子蛋白质，利用MOE软件进行分子对接。

2 结果

2.1 桑叶-桑寄生的有效成分

从TCMSP数据库中筛选得到桑叶、桑寄生的有效成分，其中桑叶有效成分29种，桑寄生有效成分2种，共同成分1种(A)，见表1。对应204个靶点。

表1 活性成分

2.2 DN相关靶点及交集靶点

从GeneCard、OMIM、DrugBank和PharmGKB数据库中共获得基因靶点3 566个。利用微生信在线软件作图工具得到共同靶点139个，并绘制韦恩图，见图1—2。

图1 DN靶点韦恩图

图2 共同靶点韦恩图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络

将上述数据整理后导入Cytoscape 3.9.0软件，构建药物-成分-靶点-疾病网络。该网络有167个节点，490条边，其中药物成分25种，共同靶点139个，见图3。

图3 药物-成分-靶点-疾病网络图

2.4 靶点PPI网络

将139个交集靶点导入STRING数据库得到PPI网络，该网络包含139个节点，2 489条边，平均度值为35.8，再导入Cytoscape 3.9.0软件，利用CytoNCA插件，以“betweenness centrality”“closeness centrality”“network”和“eigenvector”等的中位数为截值筛得23个核心靶点，分别为G1/S-特异性Cyclin-D1(CCND1)、表皮生长因子受体(EGFR)、CTNNB1、肿瘤蛋白p53(TP53)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、MYC、表皮生长因子(EGF)、ESR1、蛋白激酶B(Akt1)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、NFKBIA、血管内皮生长因子A(VEGFA)、缺氧诱导因子1(HIF1)α、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、JUN、环氧合酶2(PTGS2)、PPARG、ICAM1、白细胞介素(IL)1β、FOS和趋化因子配体2(CCL2)，见图4、表2。

表2 核心基因

图4 PPI网络筛选图

2.5 DN差异基因

检索筛选后，GSE142153数据集符合条件，下载GPL6480-9577平台文件。以|log FC|≥1且P<0.05为标准筛选到差异基因113个，其中DN上调基因63个，下调基因50个。分别取前20个基因绘制热图与火山图，见图5—6。

图5 热图

2.6 富集分析

(1)GO功能富集分析：对139个共同靶点进行GO富集分析，并将富集水平靠前者绘制成条形图，见图7。涉及的生物过程主要为对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)等。差异基因的GO富集结果显示，主要生物过程为平滑肌细胞增殖的调节(regulation of smooth muscle cell proliferation)、蛋白质水解的正向调节(positive regulation of proteolysis)等，见图8。(2)KEGG通路富集分析：共同靶点的KEGG分析结果显示，共得到176条信号通路。差异基因的KEGG分析结果显示，共得到27条信号通路。两者相较，有26条共同通路，其中富集水平靠前的通路为脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路(TNF signaling pathway)和IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等，见图9—10。

图7 共同靶点GO富集图

图8 差异基因GO富集图

图9 共同靶点KEGG富集图

2.7 分子对接

为验证桑叶-桑寄生对DN的作用，本研究将相关核心靶点与其对应的成分进行分子对接，结果见表3、图11。分子对接结合能越小，表示配体与受体结合越牢固，当结合能<-20.90 kJ/mol时，表明成分与靶点之间结合活性较高，具有较好的治疗潜力[7]。

A.Akt1与槲皮素；B.VEGFA与槲皮素；C.CASP3与槲皮素；D.TP53与槲皮素；E.MMP9与槲皮素；F.PTGS2与槲皮素

表3 分子对接结果

3 讨论

DN早期病机在于阴津亏损、燥热偏盛，常多脏腑受累，以肺、胃、肾为主，互相影响，多表现为肾阴不足而肺胃热盛。肾为先天之本，肾阴为一身阴气之根本，肾阴充足则肺胃阴津尚可得肾阴的补充。《石室秘录》记载，“消渴之证，虽有上中下之分，其实皆肾水不足也”。多症见口渴多饮、多食善饥、大便干结等。桑叶与桑寄生，一为桑树之叶，一为桑树寄生之物，此二桑兼具一母之共性。桑叶性寒，味苦、甘，具有疏风清热、清肝润肺等功效。桑寄生为桑树上感桑树精气而生的木耳，性平，味苦、甘，擅于祛风湿、补肝肾。桑叶甘寒以清润为主，桑寄生甘平以补为要，此二药相伍，共同清肺之热、滋肾之阴，皮持衡教授常将两药合用以治疗DN。

图6 火山图

β-胡萝卜素是食物中最丰富的类胡萝卜素，存在于多种蔬菜及中草药中，具有抗氧化和抗炎活性[8]。研究结果表明，β-胡萝卜素能抑制人体内自由基的产生并保留胰岛素受体，从而改善胰岛素代谢，降低胰岛素抵抗[9]。另有研究结果表明，在糖尿病大鼠模型中，β-胡萝卜素能显著提高大鼠对葡萄糖的摄取水平，改善其葡萄糖代谢以及氧化状态[10]。β-谷甾醇、山柰酚和槲皮素皆属于黄酮类化合物，其中前两者源于方中的桑叶，槲皮素则在桑叶、桑寄生中都存在。山柰酚具有抗氧化、抗炎等作用，可以通过抑制Toll样受体4/核因子κB(NF-κB)信号通路上调miR-26a-5p来减轻低密度脂蛋白诱导的动脉内皮细胞的凋亡，减轻动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化与DN密切相关[11-13]。此外，山柰酚能降低大鼠和人肾小管上皮细胞中炎症细胞因子(TNF-α和IL-1β)水平，抑制肾小管上皮细胞中转化生长因子β1、结缔组织生长因子、纤连蛋白和胶原-Ⅳ的表达，延缓糖尿病并发症特别是DN的进展[14]。β-谷甾醇、槲皮素对DN的治疗作用已被许多研究结果证明，其能通过多种信号通路缓解DN的症状，延缓DN的进程[15-17]。

VEGFA是血管生成的主要决定因素和调节因子，根据末端外显子8的不同，VEGFA可分为2种亚型，一种促血管生成，如VEGFA164a(一般称为VEGFAxxxa，xxx是编码它们的氨基酸数)；另一种拮抗血管生成，如VEGFA165b(VEGFAxxxb)[18-19]。VEGFAxxxa/VEGFAxxxb的平衡对维持肾小球基底膜的正常功能十分重要[20]。成年小鼠足细胞中，VEGFA164a过度表达会导致肾小球疾病，其特征为肾小球肥大、系膜增生、肾小球基底膜增厚、足细胞消失和蛋白尿[21]。VEGFA165b通过肾小球内皮细胞中的血管内皮细胞生长因子受体2调节肾小球通透性，并可以逆转糖尿病诱导的肾小球内皮细胞糖萼损伤[22]。MMP9基因启动子区的去甲基化可能通过调节MMP9蛋白在血清中的表达而参与DN的发生和发展[23]。HIF-1在预防糖尿病诱导的组织损伤的早期反应中起着至关重要的作用，并且HIF-1信号传导受损会导致DN的更快进展[24]。

IL-17家族目前发现了6种细胞因子(IL-17A-F)及5种相关的受体(IL-17RA-RE)[25]。IL-17通过诱导基因转录或稳定靶标mRNA转录物来调整炎症基因表达，IL-17信号传导始于IL-17A/A、IL-17A/F或IL-17F/F细胞因子与其受体IL-17RA和IL-17RC的结合，当细胞因子与对应的受体结合，NF-κB激活剂1(Act1)会激活通过不同TNF受体相关因子(TRAF)蛋白介导的NF-κB、丝裂原激活的蛋白激酶等多个独立的信号通路[26-27]。TNF家族的大部分细胞因子都能与TNF受体1(TNFR1)结合以激活NF-κB信号通路[28]。激活NF-κB信号传导最终导致巨噬细胞活化，从而导致足细胞损伤[29]。此外，TNF-α也可能对肾小球足细胞和肾小管细胞具有直接的细胞毒性作用，从而诱导细胞凋亡和细胞死亡[30]。炎症细胞因子如TNF-α、IL-6等可直接破坏肾脏结构并促进上皮细胞向间充质转化的过程，导致细胞外基质积聚，加重肾脏损害及炎症反应[31]。在DN中，足细胞结构的改变及数量的下降会促进该病的进展[32]。AGE主要存在于视网膜、血浆和肾小球内，在肾脏中，主要存在于肾小管上皮细胞、足细胞中[33]。研究结果表明，肾小球中的AGE累积可能导致肾小球纤维化、肾小管功能障碍[34]。AGE与RAGE结合会激活NF-κB、AGE-RAGE和p38等信号通路，释放各种细胞因子，导致足细胞凋亡、诱发炎症，这些都与DN密切相关[35]。

本研究运用网络药理学及生物信息学方法探究桑叶-桑寄生对DN的潜在治疗机制，并以分子对接方法加以验证。结果表明，桑叶-桑寄生可能通过β-胡萝卜素、山柰酚等成分，调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等通路治疗DN。考虑到网络药理学及生物信息学的局限性，本研究结果仍需进一步的相关实验研究加以验证。