基于网络药理学及分子对接探讨补中益气丸治疗白细胞减少症的作用机制

何浩麟，张延峰，陶 琴，雷 欢，李 雷，方海红

（江西科技师范大学药学院，江西 南昌 330013）

1 前言

白细胞减少症（leukopenia）是肿瘤放、化疗过程中出现的常见不良反应，主要特征为外周血白细胞计数持续低于4.0 × 109/L[1]。白细胞减少会导致机体免疫功能下降，易诱发感染，严重的白细胞减少症会导致败血症、脓毒血症的出现，甚至危及生命[2]。中医学无白细胞减少症之病名，据其证可归属于中医学“虚损”、“虚劳”等范畴，病机为脾肾两虚、气血不足，临床常以健脾益肾、补益气血等方药加以治疗[3，4]。

补中益气丸为中医经典名方，由黄芪、党参、白术、甘草、柴胡、升麻、当归和陈皮等多味中药配伍而成的丸剂。方剂君药为黄芪，具有补元气、气行的作用[5]；臣药党参、白术和甘草具有补中益气、健胃补脾的功效；当归活血而补血，化瘀而不伤正；陈皮理气和胃、补而不滞，升麻和柴胡联用升阳举陷为佐药，多药联用共奏补中益气、升阳举陷之功，临床常用于脾胃虚弱、中气下陷所致的体倦乏力、腹泻、脱肛等症[6，7]。临床研究表明补中益气汤可有效改善治疗化疗致白细胞减少症[8]，并有补中益气丸与六味地黄丸联合治疗白细胞减少症的相关文献报导[9]，但其治疗白细胞减少症的作用机制尚不明确。

网络药理学融合了生物信息学、系统生物学和网络科学，从生物网络和系统层次的整体角度解析药物与治疗疾病间的分子关联，揭示药物的系统性作用及机制，指导新药的研究与开发[10]。网络药理学的研究策略与中医药对疾病整体的认识相符合。构建“中药-多成分-多靶点-疾病”网络，有利于筛选中药活性成分及阐明中药的作用机制[11，12]。网络药理学广泛应用于中药及其复方的作用机制研究和探索，为复方配伍机制和探究思路提供帮助[13，14]。因此，本文采用网络药理学及分子对接技术分析了补中益气丸治疗白细胞减少症的作用机制，为其治疗白细胞减少症的临床应用提供科学依据。

2 实验方法

2.1 补中益气丸主要活性成分与作用靶点的筛选

通过中药系统药理数据库（TCMSP，www.tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索黄芪、白术、甘草、党参、陈皮、当归、柴胡以及升麻，并加以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为筛选标准挖掘补中益气丸中符合条件的活性成分以及对应靶点。通过中医药百科全书数据库（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）检索，以QED 大于0.67 及评分为Good 和Moderate为筛选标准挖掘补中益气丸中符合条件的主要活性成分以及对应靶点[15，16]。最终，将收集到的靶点合并去重整理获得补中益气丸的作用靶点。

2.2 补中益气丸的药物-活性成分-靶点网络的构建

将上述数据库收集所得到的药物主要活性成分及其对应靶点导入到Cytoscape3.9.1 中，构建复方药物-活性成分-靶点三者的网络关系，最后整合绘制得到药物-活性成分-靶点网络图。

2.3 白细胞减少症疾病靶点的获取

以“leukopenia”作为关键词，分别在人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://www.omim.org/）、DisGeNet（http://www.disgenet.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库检索，筛选并收集有关白细胞减少病症的相关靶点基因。另外，根据前期转录组测序结果进行分析，得到环磷酰胺致白细胞减少症小鼠的差异基因，将数据库检索及测序获得的基因整合获得白细胞减少症的疾病靶点。

2.4 PPI 网络的构建与核心靶标筛选

将整理且合并后的补中益气丸所对应靶点基因，以及白细胞减少疾病相关的靶基因导入到Venny2.1.0（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中，获得中药复方-疾病的交集靶点韦恩图；在STRING（http://cn.string-db.org/）数据库对得到的交集靶点进行映射，构建新的靶点网络图[12]。活性成分及作用靶点用“节”和“点”表达，节点间的相互作用关系用“边”表达。通过Cytoscape3.9.1 对补中益气丸-白细胞减少症交集靶点网络图进行分析，以“degree”、“Closeness Centrality”及“Betweenness Centrality”作为筛选的指标[17，18]，找到排名较靠前的基因，并与韦恩图所找到交集靶点基因进行汇总，可以得到补中益气丸治疗白细胞减少症的核心靶标基因。

2.5 核心靶标的GO 与KEGG 富集分析

运用注释及集成发现数据库（DAVID,https://david.Ncifcrf.gov/）对上述筛选的核心靶标基因进行分析。物种设定为“Homo sapiens”，基因修正为“official gene symbol”，进行基因本体（GO）生物功能与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析[19]。最终得到补中益气丸干预白细胞减少症的KEGG 信号通路和GO 富集分析数据。

2.6 分子对接验证

从补中益气丸中选出对应靶点较多化合物与关键核心靶点进行分子对接验证。经PubChem 得到补中益气丸关键活性成分的2D 结构，再经Chem3D进行能量最小化得到其mol2 格式。从PDB 数据库得到核心靶点代号，经PYMOL 去除核心靶蛋白的水分子及配体。使用Auto Dock Tools1.5.6 对靶蛋白加氢加电荷后将蛋白质和化合物转为受体和配体，并将其转换成pdbqt 格式后可进行分子对接操作。当结合能小于-5 kcal/mol 则说明两者具有良好结合性。最后通过PYMOL 将对接的化合物与靶标蛋白进行分子对接可视化分析。

3 结果与讨论

3.1 补中益气丸活性成分与靶点的筛选

本文通过TCMSP 与ETCM 数据库的查询与筛选得到黄芪18 个成分、白术10 个成分、甘草111 个成分、党参30 个成分、陈皮17 个成分、当归25 个成分、柴胡28 个成分及升麻12 个成分。通过删除重复项与汇总后得到补中益气丸成分共221 个，其中部分活性成分基本信息见表1。

表1 补中益气丸部分活性成分的基本信息

3.2 补中益气丸药物-活性成分-靶点网络的构建

通过Cytoscape3.9.1 构建上述获得的药物成分的药物-活性成分-靶点网络图。网络图中包含了8个药物节点，221 个活性化合物，632 个靶标节点和5127 条边。通过Cytoscape3.9.1 软件中的Analyze Networks 分析功能得到度值排名前三的化合物分别是槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）和壬酸（Nonanoic Acid）。

3.3 白细胞减少症靶点基因的获取

通过OMIM、DisGeNet 以及Drugbank 数据库筛选并且收集有关白细胞减少疾病的靶点基因共1868 个；转录组测序获得白细胞减少症小鼠与正常小鼠差异基因664 个，整合后得到白细胞减少症靶点基因共2465 个。

3.4 核心靶标的筛选及PPI 网络构建

通过Venny2.1.0 在线作图工具，得到补中益气丸药物-白细胞减少症疾病的交集靶点共94 个（图1），应用STRING 数据库对核心靶点进行PPI 网络分析，使用Cytoscape3.9.1 进行可视化处理，得到重要核心靶标网络（图2）。根据“degree”数值大小进行筛选，最终，筛选出的前十位的核心靶点，分别为AKT1、MMP9、IL1β、STAT3、PTGS2、MYC、CCL2、IL10、CREB1、FOS 等靶标基因。

图1 补中益气丸、白细胞减少症与转录组测序获得的白细胞减少症致小鼠差异基因交集靶点韦恩图A：补中益气丸对应靶标基因 B：疾病对应靶标基因

图2 核心靶点基因网络图

3.5 GO 功能注释与KEGG 通路富集分析

本文将收集得到的94 个潜在靶标导入DAVID数据库进行GO 功能注释以及KEGG 通路富集分析。根据P 值大小将GO 功能注释的生物过程（bological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）的各前10 条整理为功能富集条形图（图3）。结果显示，生物过程（BP）主要涉及细胞对碳水化合物刺激的反应、神经胶质细胞增殖的调控、正向调控浆细胞的分化及细胞对白细胞介素-17 的反应等过程；细胞组成（CC）包括核膜腔、电压门控钠通道复合物、特定颗粒管腔、基质膜以及三级颗粒管腔等；分子功能（MF）主要涉及花生四烯酸12-脂氧合酶活性、G 蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、CCR5 趋化因子受体结合及磷脂酶抑制剂活性等功能。补中益气丸可能通过上述功能来减缓白细胞减少症并起到部分升高白细胞的效果；将潜在靶点进行KEGG 通路富集共获得344 条通路（P＜0.05），显示补中益气丸治疗白细胞减少症主要涉及PI3K-Akt 以及多种白介素的信号通路、免疫细胞相关信号通路，如IL-4、IL-13、IL-17、IL-18信号通路以及Th17、TNF 信号通路和JAK-STAT 信号通路（图4）。

图3 GO 生物功能富集分析图

图4 KEGG 通路富集分析图

3.6 分子对接的验证

将核心靶点与补中益气丸的主要活性成分进行分子对接。通常认为结合能小于－5 kcal/mol 时结合性能良好，且结合能越低结合性能越好。从对接结果得知，活性成分槲皮素（Quercetin）和山奈酚（Kaempferol）与Akt1 结合度良好，结合能分别为－6.61 kcal/mol、－7.17 kcal/mol。活性成分山奈酚（Kaempferol）与IL-1β 结合度良好，结合能为－5.23 kcal/mol。运用Pymol 对结果进行可视化分析（图5）。

图5 分子对接验证图

由上述KEGG 通路富集分析表明补中益气丸的主要活性成分的潜在靶标与PI3K-Akt、炎症以及免疫等相关信号途径相关。分子对接验证也表明补中益气丸中关键活性成分槲皮素和山奈酚与Akt1、IL-1β 等核心靶点结合度良好。已知蛋白激酶（Akt）是一种原癌基因，为PI3K/AKT/mTOR 等多种信号通路中的关键基因，在调控细胞功能包括增殖、转录和代谢时发挥着重要作用[20]。研究表明PI3K/Akt/mTOR 对维持造血干细胞的自我更新具有重要作用，PI3K/Akt 的过度激活使骨髓造血干细胞脱离静止状态进入细胞周期增殖，并离开造血微环境[21]。研究发现环磷酰胺干预后，Akt1、PI3K 及pAkt 蛋白表达水平显著降低，小鼠的造血功能显著下降，白细胞数目减少，黄芪皂苷可激活PI3K 水平恢复小鼠骨髓抑制，增强免疫功能[22]。白细胞介素-1β（IL-1β）是白细胞介素家族的一类细胞因子，参与体内炎症、免疫及组织修复。有研究表明，当体内IL-1β 水平异常时，代表体内的免疫功能出现异常[23]。有学者发现，脊髓损伤会产生大量的炎症因子，包括IL-1α、IL-1β 及TNF[24]。环磷酰胺引发小鼠脊髓损伤出现白细胞减少症，小鼠体内会产生大量的炎症因子例如IL-1β 来维持体内稳定免疫功能[25]。

4 结论

本文通过网络药理学和前期测序结果初步探究了补中益气丸改善白细胞减少症的作用和机制，并利用分子对接方法对补中益气丸的主要成分和关键靶点进行了验证。显示补中益气丸的活性成分及关键靶点研究较为充分，也表明补中益气丸通过多成分、多靶点发挥协同治疗白细胞减少症的作用。但本研究仅对补中益气丸治疗白细胞减少症进行了初步的预测和分析，尚待进一步对补中益气丸的治疗白细胞减少症的机制进行科学实验验证。