LncRNA PVT1 调控 miR-1207-5p/FMNL2 对 HL-60细胞凋亡及化疗敏感性的影响*

郭毅刚，宋 斌，胡 平，张荣耀，陈 旭，易 琼，万楚成

（湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

急性髓性白血病是一种恶性克隆性疾病，占白血病患病人数的60%［1］。肿瘤发展过程中，基因改变导致细胞转化为癌前细胞群，最终形成具有侵袭和转移能力的肿瘤［2］。临床主要采用化学治疗，但耐药影响疗效［3］。有效、灵敏的治疗靶点在急性髓性白血病的治疗过程中显得尤为重要［4］。微小RNA（miR）是一种小型非编码RNA，参与细胞分化、迁移、凋亡等一系列过程，并可能与肿瘤患者的临床病理特征或预后有关［5-6］。其表达受多种因素影响，包括长链非编码RNA（LncRNAs）。LncRNAs 是一类长度超过200 个核苷酸的非蛋白质编码转录物，通过与miRNAs、mRNAs、蛋白质的相互作用发挥病理功能，长链非编码RNA 浆细胞瘤转化迁移基因1（LncRNA PVT1）异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关［7］。同源形成素样蛋白2（FMNL2）与多种癌症转移密切相关，可与miRNA或LncRNAs相互作用，参与肿瘤细胞的增殖和转移［8］。目前，关于LncRNA PVT1对miR - 1207 - 5p/ FMNL2 的调控作用尚未见报道。为此，本研究中探讨了LncRNA PVT1和miR-1207-5p对HL - 60 细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：BSC - 1100ⅡB2 - X 型生物安全柜，BKQ -B75 型高压蒸汽灭菌锅，博科300L 型CO2细胞培养箱，均购自中国博科公司；5320R 型4 ℃离心机（德国徕卡公司）；伯乐Mini - PRO TEAN 型电泳仪（美国伯乐公司）；EVOS M7000 型倒置显微镜（意大利赛默飞公司）；LAS 4000型成像系统，Bio-Rad 微孔板阅读器，均购自美国GE Healthcare 公司；BD FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪（美国赛默飞世尔科技公司）。

试药：RPMI 1640 培养基（批号为315484），胎牛血清（FBS，批号为310549），胰蛋白酶（批号为315497），柔红霉素（批号为948712），均购自美国Sigma 公司；Amplite 萤光素酶报告基因检测试剂盒（美国AATBioquest 公司，货号 AAT - 12519）；Lipofectamine 3000 转染试剂盒（南京建成生物有限公司，批号为915482）；V-荧光素异硫氰酸酯（FITC）凋亡试剂盒（美国Sun-Shine公司，批号为396765）；细胞计数试剂盒8（CCK - 8，批号123594），RNA 提取试剂盒（批号为9451894），RNA反转录试剂盒（批号3201549），实时逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）试剂盒（批号为3021948），购自上海优宁维生物有限公司；FMNL2 蛋白抗体（批号为661259），β-actin 蛋白抗体（批号549258），均购自美国Abcam公司；山羊抗兔二抗（武汉三鹰生物有限公司，批号为614948）。

细胞：HL - 60 细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

于液氮罐中取HL-60细胞株1支，进行细胞复苏，将复苏后的细胞置RPMI1640 培养基中，采用细胞培养皿进行分装，于培养箱（5%CO2，37 ℃）中培养24 h 后更换培养基，细胞覆盖率达70%时在培养皿中加入胰蛋白酶，进行细胞传代。

1.2.2 细胞分组、转染及萤光素酶的报告基因检测

将 HL - 60 细胞分为对照组、miR - NC 组、PVT1 -siRNA 组、miR - 1207 - 5p inhibitor 组和 miR - 1207 -5p mimic 组。对照组细胞不处理；miR - NC 组、PVT1 -siRNA、miR - 1207 - 5p inhibitor 组和 miR - 1207 -5p mimic 组按Lipofectamine 3000 转染试剂盒说明书方法分别将miR - NC，PVT1 - siRNA，miR - 1207 -5p inhibitor，miR - 1207 - 5p mimic 转染到 HL - 60 细胞，48 h 后用双萤光素酶检测试剂分析miR - 1207 -5p和FMNL2野生型/突变型（wt/mut）萤光素酶活性。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞存活率

取对数生长期的HL - 60 细胞，在培养皿中加入1 mL 胰蛋白酶轻微吹打2 min，使细胞完全悬浮。将悬浮的细胞转移到1.5 mL离心管中离心（转速为2 000 r/min）10 min，弃去上清液，加入1 mL RPMI 1640培养基，轻微吹打，使细胞充分悬浮，将细胞悬液转移至96 孔板中，每孔100µL，培养箱中培养24 h，弃去96孔板中的培养基，每孔依次加入新的RPMI 1640 培养基，各组6 个复孔，培养24 h，弃去培养液，每孔加入100 µL 培养液和10 µL CCK-8 溶液，持续培养3 h，于450 nm 波长处使用Bio-Rad 型微孔板阅读器读取吸光度，重复3 次，计算细胞存活率。

1.2.4 改良Matrigel Boyden 室测定法测定细胞侵袭性

将对数生长期的HL-60细胞，按5×105个/mL接种于有基质胶的滤膜上，滤膜的下室仓中放入10% FBS，作为趋化剂，培养箱中培养24 h，取出滤膜并染色，使用EVOS M7000 型倒置显微镜对滤膜上的细胞计数。计数时，每个滤膜随机选择5 个视野，重复6 次，取平均值。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移力

将对数生长期的HL-60细胞按5×105个/mL接种于6 孔板内，置培养箱中培养48 h。划痕实验时吸头垂直孔壁划痕，并加入无血清培养基，划痕完成后培养48 h，使用EVOS M7000 型倒置显微镜观察，并分析相对迁移率。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

使用FITC凋亡试剂盒，将HL-60细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，用1×结合缓冲液在1×106个/mL浓度下悬浮于400 µL V - FITC 溶液中，暗室温孵育15 min，然后加入PI 10 µL，4 ℃避光孵育5 min，立即用流式细胞仪分析细胞，重复6次。

1.2.7 MTT 法检测细胞对柔红霉素敏感性

将对数生长期的HL-60细胞，按5×105个/mL接种于96 孔板，置培养箱中常规培养24 h。以不同质量浓度（0，0.5，1，2，4，8 µg/ mL）的柔红霉素处理细胞48 h，每个剂量设置6 个复孔，处理结束后，每孔加质量浓度为 5 g/ L 的 MTT 试剂 20 µL，4 h 后加入 150 µL 二甲基亚砜，采用酶标仪于490 nm 波长处测量光密度（OD），并计算细胞增殖活力。

1.2.8 总RNA 提取及RT-qPCR

取出培养皿放入无菌操作台，弃去培养皿中的培养液。根据RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并利用反转录试剂盒得到cDNA，- 80 ℃保存备用。RT -qPCR 体系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 µL，特异性引物2.0µL，模板cDNA3.25µL，DEPC水补足至30µL。反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s；共 40 个循环。设置 6 个复孔，根据公式（2-ΔΔCt）计算、分析Cdc42和PAK1 mRNA表达，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.9 免疫印迹（Western blot）法检测细胞相关蛋白表达

取培养皿，放入无菌操作台，弃去培养皿中的培养液，加入 1 mL PBS 和 100 µL 蛋白酶 K 溶液，使细胞悬浮，超声细胞破碎仪作用2 min 破碎细胞，离心（转速3 000 r/min，4 ℃）20 min，取上清液，置新的1.5 mL EP管中。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离、转模和封闭后用特异性抗体FMNL2 和β-actin（稀释浓度1∶5 000）在4 ℃条件下孵育12 h，孵育后的条带1%吐温清洗3次，山羊抗兔二抗（稀释浓度1∶500）孵育 2 h，LAS 4000 型成像系统成像并观察结果。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 LncRNA PVT1 对 miR - 1207 - 5p 和 miR -1207-5p 对 FMNL2 的靶向作用

检索生物信息学网站www. Targetscan. org，发现LncRNA PVT1 与 miR - 1207 - 5p、miR - 1207 - 5p 与FMNL2 均有潜在的结合位点。萤光素酶分析结果显示，LncRNA PVT1 可明显增加miR - 1207 - 5p 的萤光素酶活性，miR - 1207 - 5p 可明显增加FMNL2 - wt 的萤光素酶活性，表明LncRNA PVT1 与miR-1207-5p、miR-1207-5p与FMNL2存在靶向调节作用。详见表2和图1。

图1 Targetscan预测miR-1207-5p与LncRNA PVT1和FMNL mRNA的互补配对序列Fig.1 Prediction of the complementary pairing sequences of miR -1207 - 5p with LncRNA PVT1 and FMNL mRNA by the Targetscan

表2 萤光素酶报告基因实验结果（）Tab.2 Results of luciferase reporter gene assay（）

表2 萤光素酶报告基因实验结果（）Tab.2 Results of luciferase reporter gene assay（）

注：与对照组比较，aP < 0.05；与 miR - NC 组比较，bP <0.05；与 miR - 1207 - 5p inhibitor 组比较，cP < 0.05。表 3 至表7同。Note：Compared with those in the control group，aP < 0.05；Compared with those in the miR -NC group，bP < 0.05；Compared with those in the miR-1207-5p inhibitor group，cP < 0.05（for Tab.2-7）.

FMNL2-mut 1.00±0.00 1.01±0.05 0.58±0.06ab 1.02±0.08 8.021<0.001组别对照组miR-NC组miR-1207-5p inhibitor组miR-1207-5p mimic组F值P值LncRNA PVT1-wt 1.00±0.00 1.05±0.02 1.02±0.08 1.49±0.13abc 15.068<0.001 LncRNA PVT1-mut 1.00±0.00 1.04±0.07 0.55±0.06ab 1.03±0.11 9.041<0.001 FMNL2-wt 1.00±0.00 1.02±0.03 1.07±0.05 1.46±0.14abc 16.275<0.001

2.2 LncRNA PVT1 对 miR-1207-5p 表达的影响

与对照组比较，转染PVT1 - siRNA 后，LncRNA PVT1 表达水平显著降低（P< 0.05），miR - 1207 - 5p表达水平显著升高（P<0.05）。详见表3。

表3 转染LncRNA PVT1对miR-1207-5p表达水平的影响（，n=6）Tab.3 Effects of transfection of LncRNA PVT1 on the expression level of miR-1207-5p（，n=6）

表3 转染LncRNA PVT1对miR-1207-5p表达水平的影响（，n=6）Tab.3 Effects of transfection of LncRNA PVT1 on the expression level of miR-1207-5p（，n=6）

miR-1207-5p（2- ΔΔCt）1.00±0.00 1.03±0.04 1.43±0.11ab 17.063<0.001组别对照组miR-NC组PVT1-siRNA组F值P值LncRNA PVT1（2- ΔΔCt）1.00±0.00 1.05±0.07 0.52±0.05ab 12.053<0.001

2.3 转染miR - 1207 - 5p 对细胞存活率、迁移率及侵袭力的影响

与对照组比较，miR-1207-5p inhibitor 组细胞存活率、迁移率和侵袭均数显著降低（P< 0.05），miR -1207-5p mimic组细胞存活率、迁移率和侵袭数均显著升高（P< 0.05）；对照组和miR - NC 组无显著差异（P>0.05）。详见表4和图2。

图2 转染miR-1207-5p对细胞的影响（×400）Fig.2 Effects of transfection of miR-1207-5p on the cells（× 400）

表4 转染miR-1207-5p对细胞存活率、迁移率和侵袭力的影响（，n=6）Tab.4 Effects of transfection of miR-1207-5p on the survival rate，migration rate and invasiveness of cells（，n=6）

表4 转染miR-1207-5p对细胞存活率、迁移率和侵袭力的影响（，n=6）Tab.4 Effects of transfection of miR-1207-5p on the survival rate，migration rate and invasiveness of cells（，n=6）

组别对照组miR-NC组miR-1207-5p inhibitor组miR-1207-5p mimic组F值P值细胞存活率（%）100.00±0.00 99.14±8.26 59.83±5.10ab 147.19±10.22abc 32.064<0.001细胞迁移率（%）100.00±0.00 98.79±6.33 73.86±6.19ab 136.54±10.88abc 26.481<0.001细胞侵袭数（个）151.78±11.27 152.33±10.82 97.92±7.09ab 207.58±12.94abc 38.552<0.001

2.4 转染miR-1207-5 p 对细胞凋亡率的影响

与对照组比较，miR-1207-5p inhibitor 组细胞凋亡率显著升高（P< 0.05），miR - 1207 - 5p mimic 组细胞凋亡率显著降低（P<0.05）；对照组和miR-NC组无显著差异（P>0.05）。详见图3和表5。

表5 转染miR-1207-5p对细胞凋亡率的影响（，n=6）Tab.5 Effects of transfection of miR-1207-5p on the apoptosis rate（，n=6）

表5 转染miR-1207-5p对细胞凋亡率的影响（，n=6）Tab.5 Effects of transfection of miR-1207-5p on the apoptosis rate（，n=6）

组别对照组miR-NC组miR-1207-5p inhibitor组miR-1207-5p mimic组F值P值细胞凋亡率（%）11.07±1.12 12.22±1.08 24.13±2.05ab 5.26±0.51abc 43.228<0.001

图3 转染miR-1207-5 p对细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of transfection of miR-1207-5p on the apoptosis

2.5 干扰LncRNA PVT1 对HL - 60 细胞柔红霉素敏感性的影响

与对照组比较，同质量浓度柔红霉素作用下，PVT1-siRNA组HL-60细胞的活力显著升高（P<0.05）。详见表6。

表6 干扰LncRNA PVT1对HL-60细胞柔红霉素敏感性的影响（，n=6）Tab.6 Effects of interfering the expression of LncRNA PVT1 on the sensitivity of HL-60 cells to daunorubicin（，n=6）

表6 干扰LncRNA PVT1对HL-60细胞柔红霉素敏感性的影响（，n=6）Tab.6 Effects of interfering the expression of LncRNA PVT1 on the sensitivity of HL-60 cells to daunorubicin（，n=6）

组别对照组PVT1-siRNA组t值P值0µg/mL 97.12±4.53 94.59±4.87 0.653 0.582 0.5µg/mL 82.37±3.13 88.29±3.26a 3.208 0.001 1µg/mL 72.78±3.11 81.09±3.35a 3.872<0.001 2µg/mL 61.22±3.08 70.37±3.15a 3.583<0.001 4µg/mL 50.16±3.87 59.23±3.92a 4.031<0.001 8µg/mL 39.29±3.19 50.16±3.88a 5.275<0.001

2.6 FMNL2 mRNA 和蛋白表达水平

与对照组比较，miR - 1207 - 5p inhibitor 组细胞FMNL2 mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），miR - 1207 - 5p mimic 组细胞 FMNL2 mRNA 和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）；对照组和miR-NC组无显著差异（P>0.05）。详见表7和图4。

表7 各组细胞FMNL2 mRNA和蛋白表达水平比较（，n=6）Tab.7 Comparison of FMNL2 mRNA and protein expression levels in each group（，n=6）

表7 各组细胞FMNL2 mRNA和蛋白表达水平比较（，n=6）Tab.7 Comparison of FMNL2 mRNA and protein expression levels in each group（，n=6）

组别对照组miR-NC组miR-1207-5p inhibitor组miR-1207-5p mimic组F值P值FMNL2 mRNA（2- ΔΔCt）1.00±0.00 0.98±0.07 1.42±0.09ab 0.62±0.05abc 14.273<0.001 FMNL2/β-actin 0.53±0.06 0.56±0.04 0.89±0.07ab 0.27±0.02abc 19.035<0.001

图4 各组细胞FMNL2免疫印迹图Fig.4 Western blot of FMNL2 in each group

3 讨论

急性髓性白血病具有无限增殖、分化等特点，因造血干细胞堆积而抑制造血功能［9］。病程进展缓慢，早期无明显临床症状，易错过最佳治疗时间。当细胞迅速增殖和扩散，患者出现系列异常临床症状时，多已进展至晚期［10］。目前，临床主要通过手术和化疗等进行治疗，但会出现耐药，难以达到预期效果［11］。迫切需要寻找有效、新颖的检测方法，提高疾病早期的发现率，帮助预后的预测及个性化治疗。

白血病是涉及多基因、多因素、多途径的复杂疾病，分子机制在很大程度上仍未知［12］。非编码RNA 参与癌症的发展，其中的miR通过调控靶基因的表达来发挥作用［13］。几乎每种癌症中都存在异常的miR 谱，miR位于肿瘤基因组和肿瘤相关基因组的不稳定区域［14］。对miR在肿瘤发病机制、侵袭和转移中的作用认识取得了很大进展，但临床用于疾病诊断和治疗的miR 很少。在结肠癌组织中可发现miR - 1207 - 5p 的异常表达，提示 miR - 1207 - 5p 参与了恶性肿瘤的进展［15］。通过检测白血病患者和健康人群血清中的miR水平，两者在某些miR的表达水平上存在显著差异，提示miR可能作为致/抑癌基因参与了白血病的发生［16］。多种LncRNAs在白血病细胞中表达异常，异常表达的LncRNAs可引起下游靶分子上调或下调，导致肿瘤细胞生物学改变，同时发现LncRNAs与淋巴结转移和肿瘤分期显著相关［17］。本研究中分别采用LncRNA PVT1和miR-1207-5p转染 HL-60 细胞，探讨 LncRNA PVT1 和 miR-1207-5p对HL-60 细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。结果显示，转染PVT1 - siRNA 可升高miR - 1207 - 5p 的表达水平，萤光素酶报告提示低表达PVT1可靶向升高miR-1207-5p的表达，高表达miR-1207-5p可升高HL-60细胞增殖、侵袭及迁移水平，凋亡降低，提示miR-1207-5p可能是一种促白血病基因。MTT 试验结果发现，同质量浓度柔红霉素作用下，PVT1-siRNA 组HL-60 细胞的活力显著升高，提示LncRNA PVT1的低表达可引起柔红霉素敏感性降低，可能会降低患者的化疗效果。

生物信息学分析和双萤光素酶报告基因分析证实，FMNL2 是 miR-1207-5p 的下游结合基因，过表达miR-1207-5p可下调FMNL2。有研究显示，FMNL2在多种肿瘤中均为抑癌基因，高表达FMNL2 可抑制肿瘤的发生与发展［18］。FMNL2 在大多数癌症中的作用和作用机制仍有待发现。本研究中，转染miR - 1207 -5p inhibitor 和 miR - 1207 - 5p mimic 后检测细胞内FMNL2转录及翻译水平，发现HL-60细胞转染miR-1207-5p mimic后可导致细胞内FMNL2表达水平降低，升高细胞增殖、迁移及侵袭水平，同时抑制细胞凋亡，提示FMNL2在白血病中起疾病抑制作用，miR-1207-5p表达抑制FMNL2的水平，减弱疾病抑制作用。

综上所述，HL-60细胞中低表达LncRNA PVT1可靶向上调miR - 1207 - 5p 水平，上调的miR - 1207 - 5p可通过抑制FMNL2 的表达以促进细胞的增殖、侵袭和迁移，同时降低细胞凋亡水平和对柔红霉素的敏感性，不利于疾病的治疗。