脑脊液miR-139、miR-22水平对肺腺癌脑转移瘤的诊断价值研究*

代洛阳，刘玉洁，许 可，李 涛△，龚虹云

武汉大学人民医院：1.神经内科;2.肿瘤中心，湖北武汉 430060

脑转移瘤是恶性肿瘤的一种并发症，是导致肿瘤患者死亡的重要原因。有研究显示，非小细胞肺癌是脑转移瘤的原发肿瘤之一，非小细胞肺癌患者脑转移的发生率超过20%[1]。肺腺癌是非小细胞肺癌最常见的亚型，约占肺癌患者的40%，与其他亚型的非小细胞肺癌相比，其发生早期远处转移和脑转移的概率较高[2]。脑转移瘤是肺腺癌预后不良的危险因素，会使患者中位生存时间显著减少[3]，因此找寻新的特异性诊断标志物和治疗靶点，对早期诊断和治疗肺腺癌脑转移瘤具有重要的价值。研究发现微小RNA(miRNA)的异常表达与多种疾病发生密切相关，miRNA参与肿瘤的发生、发展过程，是疾病早期诊断的潜在生物标志物[4]。miR-139在乳腺癌组织及癌细胞中低表达，是浸润性乳腺癌治疗的潜在靶点[5]。miR-139-5p有抑癌作用，与非小细胞肺癌临床病理参数相关[6]。miR-22同有抑癌作用，在上皮性卵巢癌患者血清中低表达，可作为卵巢癌早期诊断的生物标志物[7]。YANG等[8]研究显示，miR-22-3p模拟物可抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡。miR-139、miR-22均参与了非小细胞肺癌的发生、发展过程，与癌细胞增殖、转移相关，但它们是否与肺腺癌脑转移瘤发生有关目前报道较少。本研究通过检测肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液miR-139、miR-22水平，探讨其对肺腺癌脑转移瘤的诊断价值，以期为临床诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2021年12月本院收治并确诊为肺腺癌脑转移瘤患者80例作为肺腺癌脑转移组，男43例、女37例，年龄47～78岁，平均(60.26±7.13)岁，其中吸烟者30例。另外，选取同期单纯肺腺癌无转移患者60例作为肺腺癌无转移组，男35例、女25例，年龄46～80岁，平均(60.37±6.94)岁，其中吸烟者25例。纳入标准：(1)符合肺腺癌诊断标准[9]，且经组织病理学证实；(2)经颅脑磁共振检查诊断为脑转移；(3)为初治患者，进行本研究前未行放、化疗等相关治疗；(4)有完整临床资料的患者。排除标准：(1)有代谢性或传染性疾病；(2)肝、肾等重要脏器功能不全；(3)有其他恶性肿瘤病史。肺腺癌脑转移组和肺腺癌无转移组比较，年龄、性别、吸烟史差异均无统计学意义(P>0.05)，原发肿瘤数目、原发肿瘤分化程度、淋巴结转移差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。本研究经医院伦理委员会批准同意，患者及家属均签署知情同意书。

表1 肺腺癌无转移组和肺腺癌脑转移组一般资料比较

1.2方法

1.2.1脑脊液标本收集 患者在进行腰椎穿刺或鞘注化疗时，抽取脑脊液10 mL置于无菌离心管中，于-20 ℃保存，待测。

1.2.2实时荧光定量PCR测定脑脊液中miR-139、miR-22水平 采用Trizol试剂[购自上海通蔚生物有限公司，批号：KM10574]提取脑脊液总RNA。然后，将其反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增反应。反转录试剂盒(批号J-6041L)和PCR试剂盒(批号M-3017L)均购自北京索莱宝科技有限公司。操作步骤严格按照说明书执行，以U6为内参，反应条件：50 ℃预变性2 min；95 ℃ 5 s，70 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。引物由上海通蔚生物有限公司合成，引物序列见表2。用2-ΔΔCt法计算miR-139、miR-22相对表达水平。

表2 引物序列

1.2.3肺腺癌细胞培养、转染及分组 人肺腺癌细胞株A549购自武汉尚恩生物技术有限公司(批号：CSA-30172)。A549细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中，在含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。A549细胞在不含抗菌药物的完全培养基中培养24 h后，根据Lipofectamine 3000试剂盒(武汉尚恩生物技术有限公司，批号：CSA-60157)说明书，将购自武汉华联科生物公司的miR-139模拟物(mimic)、miR-22 mimic、miR-139抑制物(inhibitor)、miR-22 inhibitor分别以50 nmol/L的浓度转染至A549细胞，依次记为miR-139 mimic组、miR-22 mimic组、miR-139 inhibitor组、miR-22 inhibitor组，另以未转染的正常A549细胞作为对照(Control)组。转染48 h后，收集各组A549细胞，用Trizol试剂提取总RNA，然后按照1.2.2中的方法检测miR-139、miR-22的水平，以此判断转染是否成功。各组均设6个平行检测样本。

1.2.4Transwell实验评价肺腺癌细胞侵袭能力 转染48 h后收集细胞，88 μm孔径的插入物被放置在24孔板中，以分离上腔与下腔。上腔预涂基质胶后，加入含(3～5)×104个细胞的细胞悬液200 μL，下腔加入含20%FBS的DMEM培养基500 μL，侵袭下腔的细胞用70%甲醇固定，24 h后用0.5%结晶紫处理，于倒置显微镜(北京诚聚德生物技术有限公司，型号IX83)下计数侵袭细胞数。

1.2.5细胞划痕实验检测肺腺癌细胞迁移能力 转染48 h后收集细胞，均匀铺种于6孔板中，细胞贴壁后，用200 μL无菌枪头垂直划过板底的细胞层，形成划痕，滴加无菌PBS洗涤去除漂浮细胞，即刻在光镜下拍照，标记为0 h，加入2 mL含1% FBS的培养基继续培养24 h后，光镜下拍照观察划痕愈合情况，标记为24 h。采用ImageJ软件测量划痕距离，划痕愈合率可表示细胞迁移能力(划痕愈合率越高代表细胞迁移能力越强)，划痕愈合率=(0 h划痕距离-24 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%。

2 结 果

2.1肺腺癌无转移组和肺腺癌脑转移组患者脑脊液中miR-139、miR-22水平比较 与肺腺癌无转移组相比，肺腺癌脑转移组患者脑脊液中miR-139、miR-22水平显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 肺腺癌无转移组和肺腺癌脑转移组患者脑脊液中miR-139、miR-22水平比较

2.2肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平与临床病理参数的关系 根据肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平的平均值(分别为0.76、0.77)将其进行分组：miR-139高表达组35例(miR-139≥0.76)，miR-139低表达组45例(miR-139<0.76)；miR-22高表达组32例(miR-22≥0.77)，miR-22低表达组48例(miR-22<0.77)。肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平与年龄、性别、是否吸烟无关(P>0.05)，与原发肿瘤数目、原发肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)，见表4。

表4 肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平与临床病理参数的关系[n(%)]

2.3肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平的相关性分析 Pearson相关分析显示，肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139与miR-22水平呈正相关(r=0.432，P=<0.001)，见图1。

图1 肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平的相关性分析

2.4影响肺腺癌患者发生脑转移瘤的危险因素分析 将2.2中有统计学意义的变量(原发肿瘤数目、原发肿瘤分化程度、淋巴结转移、miR-139、miR-22)行多因素Logistic回归分析，结果显示：多个原发肿瘤、原发肿瘤低分化、淋巴结转移、miR-139低表达、miR-22低表达是肺腺癌患者发生脑转移瘤的独立危险因素(P<0.05)，见表5。

表5 Logistic回归分析影响肺腺癌患者发生脑转移瘤的危险因素

2.5脑脊液中miR-139、miR-22水平对肺腺癌患者发生脑转移瘤的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，脑脊液中miR-139、miR-22单独及二者联合诊断肺腺癌患者发生脑转移瘤的曲线下面积(AUC)分别为0.827、0.795、0.953，二者联合优于miR-139、miR-22各自单独诊断(Z=1.766、2.178，P=0.038、0.029)。见图2、表6。

表6 脑脊液中miR-139、miR-22水平对肺腺癌患者发生脑转移瘤的诊断价值

图2 脑脊液中miR-139、miR-22水平诊断肺腺癌患者发生脑转移瘤的ROC曲线

2.6miR-139、miR-22高低表达对肺腺癌细胞侵袭、迁移的影响 与Control组相比，miR-139 mimic组miR-139、miR-22 mimic组miR-22水平均显著升高(P<0.05)，miR-139 mimic组和miR-22 mimic组侵袭细胞数、划痕愈合率显著降低(P<0.05)；与Control组相比，miR-139 inhibitor组miR-139、miR-22 inhibitor组miR-22水平显著降低，miR-139 inhibitor组和miR-22 inhibitor组侵袭细胞数、划痕愈合率显著增加(P<0.05)。见图3、表7。

图3 各组肺腺癌细胞侵袭(结晶紫染色，×200)和迁移(×100)图

表7 miR-139、miR-22高低表达对肺腺癌细胞侵袭、迁移的影响

3 讨 论

脑转移瘤是恶性肿瘤致死性并发症，常发生在肺腺癌晚期，会引起中枢神经系统受累，造成机体神经功能异常。目前，临床对于肺腺癌患者治疗多采用放疗和化疗，以提高肿瘤局部控制率和延长患者生存期，但发生脑转移的概率增加[10]。脑转移患者的预后较差，若不予治疗，多数患者死于神经功能系统衰退。miRNA是一种短链非编码RNA，与肿瘤的发生紧密相关，miRNA可以通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区结合调节其降解蛋白或抑制蛋白翻译，参与肿瘤细胞增殖、分化、迁移、侵袭等各个阶段，可作为潜在的肿瘤诊断生物学标志物。

miR-139是一种肿瘤抑制因子，在肺鳞癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等多种癌组织和细胞中表达下调。ZHANG等[11]研究显示，miR-139-5p在非小细胞肺癌细胞和组织中表达显著下调，在体外miR-139-5p过表达可显著抑制癌细胞的活力和增殖并诱导其凋亡，抑制miR-139-5p表达可以促进非小细胞肺癌细胞增殖和化疗耐药性的产生。提示，miR-139与非小细胞肺癌的发生、发展有关。miR-22位于第17号染色体上，由22个核苷酸组成。miR-22的表达失调与多种癌症疾病发生、发展过程密切相关。WONGJAMPA等[12]研究显示，miR-22在宫颈癌中是一个抑癌因子，可以抑制癌细胞增殖和迁移并诱导其凋亡，是宫颈癌的候选治疗靶标。HE等[13]研究显示，miR-22-3p在非小细胞肺癌组织和细胞中表达显著降低，可能为非小细胞肺癌提供潜在的生物标志物和治疗靶标。本研究发现，肺腺癌脑转移组患者脑脊液中miR-139、miR-22水平显著低于肺腺癌无转移组，提示miR-139、miR-22的异常表达参与肺腺癌脑转移瘤的发生。

肺腺癌发生脑转移的机制较为复杂，肺腺癌的N分期、M分期、TNM分期、近期疗效可能是影响肺腺癌脑转移的重要因素[14]。本研究发现，肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22水平与原发肿瘤数目、原发肿瘤分化程度、淋巴结转移有关，提示miR-139、miR-22水平可能成为肺腺癌脑转移的潜在生物标志物。miR-139、miR-22水平呈正相关，表明二者可能存在相互作用关系。SHAO等[15]研究报道，通过生物信息学方法分析非小细胞肺癌中miRNA与mRNA相互作用失调的网络，预测miR-139-5p为诊断非小细胞肺腺癌的新型生物标志物。本研究发现，miR-139低表达、miR-22低表达是肺腺癌患者发生脑转移瘤的危险因素，脑脊液中miR-139、miR-22对肺腺癌脑转移瘤具有一定的诊断价值，二者联合用于诊断的效果更好。此外，本研究中的细胞实验结果说明miR-139、miR-22可通过调控肺腺癌细胞的侵袭和迁移影响脑转移瘤的发生，进一步证实miR-139、miR-22对肺腺癌脑转移瘤具有一定的诊断价值。

综上所述，肺腺癌脑转移瘤患者脑脊液中miR-139、miR-22均呈低表达，二者对肺腺癌脑转移瘤均有一定的诊断价值。但本研究还有一些不足，如未对患者进行随访，还需扩大样本量，进一步实施多中心的前瞻性试验研究。