基于NF-κB/NLRP3通路的芍药苷对缺氧诱导视网膜Müller细胞的影响

孔令春，邹红，李景景，杨宇琴，唐慧新，缪晚虹

上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203

视网膜缺氧性损伤可发生在多种视网膜血管性疾病中，如糖尿病视网膜病变、视网膜动静脉阻塞及年龄相关性黄斑病变等。缺氧可造成视网膜结构和功能损伤，特别是视网膜神经节细胞减少或死亡，导致视力不可逆性丧失。因此，保护视网膜缺氧损伤尤为重要。目前，有关视网膜缺氧造成组织破坏的机制研究较多，包括氧化应激损伤、谷氨酸兴奋毒性损伤、凋亡基因表达、神经免疫调节、炎症损伤、病理性血管新生等[1-2]。缺氧可导致血管内皮生长因子（VEGF）表达增加，从而增加视网膜血管渗透性，引起视网膜水肿[3]。研究发现，视网膜缺氧损伤过程伴有炎症因子释放[4]，NLRP3炎症小体作为固有免疫系统的重要组成部分，通过感知组织损伤、介导炎症反应等参与多种眼部疾病的发生发展[5]。研究显示，激活NLRP3炎症小体既可促进VEGF生成[6]，也可促进多种炎症因子释放[7]。

芍药苷是赤芍和白芍的共有成分，具有抗自由基损伤、抑制炎症、抗纤维化、神经保护等作用[8-9]。研究发现，芍药苷可通过抑制NLRP3炎症小体延缓视网膜缺血性损伤大鼠视网膜神经节细胞凋亡[10]。Müller细胞作为视网膜细胞的主要大型特化的星形胶质细胞，参与血-视网膜屏障的形成，在视网膜损伤过程中起重要作用。有研究表明，芍药苷可通过降低大鼠血糖及抑制胶质细胞活化，降低视网膜谷氨酸含量，保护视网膜Müller细胞[11]。但芍药苷是否能通过抑制VEGF产生和炎症发挥对视网膜Müller细胞的保护作用尚不清楚。基于此，本研究通过诱导大鼠视网膜Müller细胞rMC-1缺氧模型，观察芍药苷的保护作用及对NF-κB/NLRP3通路相关基因和蛋白表达的影响，为芍药苷治疗视网膜血管性疾病提供依据。

1 实验材料

1.1 细胞及药物

大鼠视网膜Müller细胞rMC-1，美国Kerafast公司。芍药苷，美国Selleck公司，批号S241006。将芍药苷粉末溶于二甲基亚砜，制成0.5 mol/L贮备液，-20 ℃避光保存，临用前用培养基稀释成所需浓度。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基，美国Gibco公司，批号2366072；胎牛血清（FBS），美国Gibco公司，批号2021472；CCK8试剂盒，日本DOJINDO公司，批号CK04；白细胞介素（IL）-1β、VEGF ELISA试剂盒，上海司鼎生物科技有限公司，批号分别为SDR0004、SDR0041；Trizol RNA提取试剂，美国Invitrogen公司，批号15596018；qPCR试剂盒，日本TAKARA，批号RR420A；BCA蛋白定量试剂盒，上海司鼎生物科技有限公司，批号SD0012；兔核因子（NF）-κB p65单克隆抗体，美国CST公司，批号#8242；NLRP3抗体、半胱氨酸蛋白酶-1前体（pro-Caspase-1）+p10+p12单克隆抗体、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体，英国Abcam公司，批号分别为ab263899、ab179515、ab180799；β-actin抗体，上海司鼎生物科技有限公司，批号SD0034。

CO2培养箱（日本SANYO公司，型号MCO-15AC），三气培养箱（中国华仪宁创公司，型号Smartor 118），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司，型号CX41），qPCR仪（瑞士Roche公司，型号LightCycler®480II），SDS-PAGE微型凝胶电泳及转膜设备（美国Bio-Rad公司，型号1645050），低温高速离心机（德国Eppendorf公司，型号5810R），酶标仪（美国Thermo公司，型号Multiskan FC）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

rMC-1细胞用含10% FBS、1%青链霉素的DMEM培养基，置37 ℃、5%CO2培养箱培养，1～2 d换液1次，细胞生长融合至85%时，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用完全培养基终止消化后，以1∶3比例传代，取对数生长期的3～6代细胞用于实验。

2.2 造模及给药条件筛选

将细胞以1×105个/孔接种至96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱常规培养24 h后，转移至缺氧培养箱（1%O2）缺氧处理6、24、48 h，另设对照组正常培养相同时间，每组6个复孔，CCK8法检测细胞活力，确定造模条件。

确定造模条件后，将细胞分为对照组、模型组和不同浓度芍药苷组，对照组正常培养，模型组缺氧培养48 h，芍药苷组造模同时加入终浓度分别为0、10、100、200、600、1 200 μmol/L的芍药苷处理细胞，CCK8法检测细胞活力，确定芍药苷给药浓度。

2.3 分组干预

将细胞分为对照组、模型组和芍药苷高、低浓度组，根据确定的造模和给药条件对照组正常培养，模型组缺氧培养48 h，芍药苷高、低浓度组缺氧培养同时加入1 200、600 μmol/L芍药苷处理，干预结束后收集细胞和上清液进行后续检测。

2.4 CCK8法检测

细胞按分组处理后，每孔加入CCK8溶液10 μL，置于培养箱孵育3 h，酶标仪波长450 nm处检测各孔OD值，计算细胞活力（实验组OD值÷对照组OD值×100%）。

2.5 ELISA检测

收集细胞上清液，按试剂盒说明书操作，检测VEGF、IL-1β含量。

2.6 Western blot检测

收集细胞，按蛋白抽提试剂盒说明书提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，取20 μg蛋白进行凝胶电泳，转膜后分别加入NF-κB p65一抗（1∶1 000）、NLRP3一抗（1∶1 000）、ASC一抗（1∶2 000）、pro-Caspase-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入HRP标记二抗（1∶20 000），37 ℃孵育1 h，显影后用Image J 1.8.0软件分析目的蛋白灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值比值作为蛋白相对表达量。

2.7 RT-PCR检测

收集细胞，Trizol提取总RNA，测定RNA浓度和纯度，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照qPCR 试剂盒说明书进行 IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA扩增。反应体系：cDNA 1 μL，上、下游引物各 1 μL，2×Green Mix 10 μL，去离子水 7 μL；反应条件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物由上海司鼎生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

4 结果

4.1 实验条件建立

CCK8实验结果显示，与对照组比较，缺氧培养6、24 h，rMC-1细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05），缺氧培养48 h，rMC-1细胞活力显著降低（P＜0.001），见图1。故后续实验选择缺氧培养48 h为造模条件。

图1 缺氧不同时间对rMC-1细胞活力的影响（，n=6）

不同浓度芍药苷处理细胞后，与模型组比较，0～200 μmol/L芍药苷对细胞活力无显著影响（P＞0.05），600、1 200 μmol/L芍药苷可显著提高rMC-1细胞活力（P＜0.05，P＜0.01），见表2。故选择芍药苷浓度600和1 200 μmol/L用于后续实验。

表2 不同浓度芍药苷对rMC-1细胞活力的影响（，%）

表2 不同浓度芍药苷对rMC-1细胞活力的影响（，%）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

浓度/（μmol/L） 细胞活力100 77.48±13.86*77.14± 9.93 81.13±10.10 84.55± 8.93 83.66±13.06 89.84±11.45#98.59±10.34##组别对照组模型组芍药苷组0 10 100 200 600 1 200 n 6 6 6 6 6 6 6 6

4.2 芍药苷对模型细胞上清液血管内皮生长因子和白细胞介素-1β含量的影响

与对照组比较，模型组细胞上清液VEGF、IL-1β含量显著增加（P＜0.01，P＜0.001）；与模型组比较，芍药苷低、高浓度组细胞上清液VEGF、IL-1β含量显著减少（P＜0.01，P＜0.001）。见图2。

图2 各组rMC-1细胞VEGF、IL-1β含量比较（，n=3）

4.3 芍药苷对模型细胞NF-κB/NLRP3通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；与模型组比较，芍药苷高浓度组细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达显著降低（P＜0.01，P＜0.001）。见图3、表3。

表3 各组rMC-1细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达比较（）

表3 各组rMC-1细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

pro-Caspase-1 0.090±0.007 0.195±0.011***0.053±0.008###0.115±0.003###组别对照组模型组芍药苷高浓度组芍药苷低浓度组n 3 3 3 3 NF-κB p65 0.347±0.033 0.462±0.052*0.250±0.012###0.354±0.037#NLRP3 0.320±0.030 0.581±0.021***0.278±0.026###0.451±0.027##ASC 0.023±0.003 0.118±0.027**0.028±0.004##0.127±0.036

图3 各组rMC-1细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白免疫印迹

4.4 芍药苷对模型细胞白细胞介素-1β、血管内皮生长因子和NF-κB/NLRP3通路相关基因表达的影响

与对照组比较，模型组细胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1基因表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；与模型组比较，芍药苷高浓度 组 细胞 IL-1β、VEGF、NF-κB、 NLRP3、 ASC、Caspase-1基因表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。见表4。

表4 各组rMC-1细胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 基因表达比较（）

表4 各组rMC-1细胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 基因表达比较（）

注：与对照组比较，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

Caspase-1 1.013±0.202 2.752±0.250***1.454±0.125###2.096±0.188#组别对照组模型组芍药苷高浓度组芍药苷低浓度组n 3 3 3 3 IL-1β 1.004±0.114 9.938±2.693***1.070±0.323###2.347±0.602###VEGF 1.001±0.073 5.352±0.097***0.545±0.073###1.275±0.066###NF-κB 1.000±0.024 2.235±0.261***1.609±0.227##1.787±0.076#NLRP3 1.034±0.338 7.005±0.708***3.331±0.605###5.903±0.315 ASC 1.003±0.103 1.641±0.080***1.004±0.071###1.265±0.091##

5 讨论

Müller细胞自内界膜贯穿整个视网膜到达外界膜，是视网膜内最主要的神经胶质细胞，占视网膜胶质细胞的90%。它能维持视网膜组织及结构的完整，并参与神经元营养运输，在维持渗透压稳定、调节突触发育、维持电解质平衡及调节血-视网膜屏障等方面有至关重要的作用[12]。Müller细胞参与多种视网膜疾病[13]，是许多生长因子和炎症因子产生的重要来源[14-15]。视网膜缺氧引起一系列应激反应，使Müller细胞激活，异常分泌VEGF，导致视网膜血管内皮细胞损伤，增加血管通透性，使毛细血管闭塞，进而加重视网膜缺血缺氧和促进新生血管生成[16]。此外，炎症在缺血缺氧性视网膜疾病中的作用近年来受到广泛关注。缺氧和视网膜炎症密切相关[16-17]，当视网膜受到缺氧刺激时，Müller细胞活化，表现为反应性胶质激活，分泌大量炎症细胞因子和趋化因子，如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α等参与视网膜局部炎症发展[18]。本研究选用Müller细胞rMC-1为研究对象，用缺氧培养方式模拟人体视网膜缺氧，发现缺氧培养48 h后，细胞活力明显受到抑制，ELISA和PCR结果显示，缺氧培养后，模型组rMC-1细胞分泌VEGF、IL-1β较对照组显著增加，而芍药苷高、低浓度组细胞IL-1β、VEGF较模型组减少，且相应基因表达显著降低，表明芍药苷对缺氧诱导的rMC-1细胞VEGF、IL-1β分泌有抑制作用。

NLRP3炎症小体作为固有免疫系统的重要组成部分，是由核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3（NLRP3）、ASC和pro-Caspase-1组成的多蛋白复合物[19]。NLRP3炎症小体活化包括启动和激活2个步骤，启动阶段由Toll样受体或细胞因子受体诱导，它们识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），使NF-κB活化，促进NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18转录和翻译，PAMPs和DAMPs则促进NLRP3、ASC及pro-Caspase-1相结合，形成炎症小体，活化Caspase-1，活化的Caspase-1将pro-IL-1β和pro-IL-18剪切为成熟形式，从而诱导下游炎症反应，加重视网膜局部炎症[20]。

研究发现，抑制NLRP3炎症信号通路可改善VEGF诱导的视网膜血管新生和渗漏[21]；激活的NLRP3炎症小体通过上调HIF-1α/VEGF轴促进人视网膜毛细血管内皮细胞VEGF分泌[6]；缺氧可诱导人视网膜色素上皮细胞NLRP3炎症小体启动和激活，促进VEGF基因表达和分泌[22]。也有研究指出，高糖诱导能显著提高人视网膜色素上皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平，且与高糖活化NF-κB和激活NLRP3炎症小体有关[23]。Zhang等[7]发现，慢性高眼压大鼠NLRP3炎症小体激活同时，TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-18等促炎因子含量增加。可见，在视网膜病变中，NLRP3炎症小体与VEGF表达关系密切。

芍药苷为水溶性单萜糖苷，具有镇静、护肝、抗炎和调节免疫等多种作用[24]。芍药苷的抗炎作用研究尤为广泛，包括类风湿关节炎[25]、神经炎症[26]、糖尿病足溃疡[27]等。本研究结果显示，芍药苷能降低缺氧rMC-1细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1基因及蛋白表达，提示其可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制NLRP3炎症小体激活，进而抑制视网膜炎症反应。

综上所述，芍药苷可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路下调细胞因子VEGF、IL-1β表达，减轻缺氧诱导的视网膜Müller细胞损伤。但其与该通路的具体结合方式及其他作用途径尚不清楚，有待后期进一步深入探究。本研究结果可为缺氧性视网膜血管疾病的防治提供一定参考。