活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠SIRT1/PGC-1α信号通路的影响

周德生 ，谭惠中 ，陈瑶 ，刘利娟 ，李中 ，高晓峰 ，郭纯 ，颜思阳

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

脑卒中是临床上最主要的致死和致残原因之一，包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。2020年全球疾病负担研究表明，我国脑卒中终生发病率高达39.3%，居全球首位[1]。脑缺血急性期的治疗原则是尽早恢复血液灌注，但可能增加脑组织病理损害和出血转化风险，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[2]。CIRI病理过程涉及多种因素，脑组织能量代谢紊乱是首要环节[3]，而线粒体功能异常、供能障碍是关键因素。沉默信息调节因子1（SIRT1）可通过多途径实现对CIRI的神经保护作用[4-5]。SIRT1及其底物过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）可作用于线粒体以调节能量代谢[6]，主要机制在于SIRT1激活可使PGC-1α去乙酰化，激活的PGC-1α进入细胞核，参与能量代谢及线粒体生物发生相关基因表达，有助于减少神经元死亡[7]。

CIRI属中医学“中风”范畴。课题组认为其病机与荣气虚滞联系密切[8]，而作为细胞内“动力工厂”的线粒体功能可反映荣气的部分作用，线粒体供能异常与荣气失调均表现为多系统和组织的病理反应[8]。前期研究发现，基于荣气虚滞理论立方的活血荣络方能调节血浆偶联因子6及线粒体Ca2+浓度，减轻神经功能缺损[9]，同时可激活线粒体自噬，减轻大鼠CIRI[10-11]。本研究通过建立CIRI大鼠模型，以SIRT1/PCG-1α通路为切入点，探讨活血荣络方可能的作用机制，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

12～15周龄健康雄性SPF级SD大鼠60只，体质量250～280 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002。分笼饲养于湖南中医药大学SPF级动物中心实验室，动物使用许可证号SYXK（湘）2015-0003，适应性饲养1周后开始实验。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审批（20201010-13）。

1.2 药物及制备

活血荣络方（鸡血藤60 g，石楠藤60 g，生地黄30 g，玄参20 g，黄精30 g，乳香20 g，没药20 g，川芎20 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，并经湖南中医药大学第一附属医院张裕民主任药师鉴定。参照课题组前期方法[12]制成浸膏。艾地苯醌片，齐鲁制药有限公司，批号9G0821D57，0.3 g/片，将药片充分研磨后置于蒸馏水中，配制成0.8 mg/mL混悬液。SIRT1抑制剂EX-527，美国Selleck公司，货号S1541，参照说明书配制成浓度为20 mg/mL母液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 主要试剂与仪器

三磷酸腺苷（ATP）含量测定试剂盒，上海碧云天，货号S0026；DAB显色剂，丹麦DAKO，货号K3468；SIRT1抗体、PGC-1α抗体、HRP标记山羊抗兔IgG，英国Abcam，货号分别为 ab189494、ab191838、ab6721；First Strand cDNA Synthesis Kit、RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX），武汉Servicebio，货号分别为G3013、G3330、G3321。大鼠栓线（北京西浓，货号分别为2636A4、2638A4），石蜡切片机（德国Leica，型号2245），低温高速离心机（美国Thermo Scientific，型号Fresco17），凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad，型号Chemi DocTMXRS+），电泳/转膜装置、荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad，型号分别为1658001、C1000 TouchTMThermal Cycler），超净工作台（苏净安泰，型号SW-CJ-1FD），多功能酶标仪（美国Perkinelmer，型号Enspire），超纯水仪（美国Millipore，型号Milli-QIQ-7000）。

1.4 分组、造模及给药

60只大鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组、模型组、活血荣络方组、EX-527组、EX-527+活血荣络方组和艾地苯醌组，每组10只。除假手术组外，参照Longa等[13]大脑中动脉阻塞/再灌注方法建立CIRI大鼠模型，插入栓线梗阻右侧大脑中动脉，梗阻2 h后拔出栓线进行再灌注。假手术组仅分离血管，不插入栓线。造模前36 h首次给药，活血荣络方组和活血荣络方+EX-527组予1.17 g/mL活血荣络方浸膏稀释液11.7 g/kg灌胃，艾地苯醌组予艾地苯醌混悬液8 mg/kg灌胃[14]，之后每隔24 h给药1次，共3次。假手术组、模型组、EX-527组予蒸馏水10 mL/kg灌胃。EX-527组和活血荣络方+EX-527组于再灌注前20 min腹腔注射EX-527（5 mL/kg），其余各组注射等体积生理盐水。

1.5 神经功能缺损评分

再灌注后24 h后，按Zea-Longa 5级评分法[13]对大鼠进行神经功能缺损评分。0分：正常活动，提尾时两前爪伸向地面，无神经缺损症状；1分：提尾时对侧前肢不能完全伸直，爬行时向对侧转圈；2分：提尾时对侧前肢屈曲内收，爬行时向对侧转圈；3分：站立不稳，爬行时向偏瘫侧跌倒；4分：有意识障碍，不能够自发行走。分值越高表明神经功能缺损越严重。

1.6 HE染色

再灌注24 h后，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，先后用生理盐水200 mL、4%多聚甲醛经心脏灌流，断头取脑，取损伤侧脑组织置于4%多聚甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋、冠状位切片、脱蜡、复水、HE染色后，在光学显微镜下观察缺血皮质区病理变化，每组随机取5个不同视野观察损伤细胞，计数每个视野的细胞总数及损伤细胞数，计算细胞损伤率（损伤细胞数÷细胞总数×100%）。

1.7 三磷酸腺苷含量测定

大鼠置于冷冻台上分离右侧缺血皮质区组织（约15 mg），PBS冲洗后加入ATP检测缓冲液，冰上充分匀浆，4 ℃、13 000 r/min离心5 min，吸取上清液于另一干净离心管内，参照ATP检测试剂盒说明书配制工作液，计算缺血皮质区ATP含量。

1.8 免疫组化检测

脑组织石蜡切片常规脱蜡、脱水、抗原修复、漂洗、封闭，分别滴加SIRT1、PGC-1α一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片，显微镜（×400）下观察，阳性染色呈棕黄色或棕褐色，随机选取5个视野，用Image J软件分别计算SIRT1、PGC-1α阳性表达的平均光密度。

1.9 RT-qPCR检测

取缺血皮质区脑组织100 mg，加入1 mL Trizol，匀浆机充分研磨提取总RNA，检测RNA浓度及纯度。将RNA反转录为cDNA后，按试剂盒说明书进行扩增。反应体系：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物1.5 μL，反转录产物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：95 ℃预变性 10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40个循环。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 活血荣络方对模型大鼠神经功能缺损评分的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，活血荣络方组、艾地苯醌组大鼠神经功能缺损评分明显降低（P＜0.05），EX-527组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05）；与活血荣络方组比较，活血荣络方+EX-527组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05）；艾地苯醌组与活血荣络方组神经功能缺损评分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较（，分）

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较（，分）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与活血荣络方组比较，#P＜0.05

评分0 2.80±0.60*1.80±0.60▲3.40±0.49▲#3.00±0.30#1.60±0.66▲组别假手术组模型组活血荣络方组EX-527组活血荣络方+EX-527组艾地苯醌组只数10 10 10 10 10 10

2.2 活血荣络方对模型大鼠缺血皮质区神经元损伤的影响

假手术组大鼠缺血皮质区神经元结构清晰，排列致密，形态整齐，偶见细胞损伤；模型组大鼠缺血皮质区神经元萎缩变形，排列紊乱，核仁消失，细胞周围间隙增大，胞质深染，胞质内空泡形成，神经元损伤严重；活血荣络方组和艾地苯醌组大鼠缺血皮质区神经元空泡样变、核固缩情况减轻，细胞周围间隙减小，部分神经元坏死，但整体较模型组改善；EX-527组大鼠缺血皮质区神经元损伤加重，胞体固缩深染加重，细胞周围间隙增宽，细胞空泡样变明显；活血荣络方+EX-527组大鼠缺血皮质区神经元排列欠规整，胞体固缩变形，神经元坏死和凋亡较活血荣络方组增多。见图1。

图1 各组大鼠缺血皮质区形态（HE染色，×400）

与假手术组比较，模型组大鼠缺血皮质区细胞损伤率升高（P＜0.05）；与模型组比较，活血荣络方组和艾地苯醌组大鼠缺血皮质区细胞损伤率降低（P＜0.05），EX-527组大鼠缺血皮质区细胞损伤率升高（P＜0.05）；与活血荣络方组比较，活血荣络方+EX-527组大鼠缺血皮质区细胞损伤率升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠缺血皮质区细胞损伤率比较（，%）

表3 各组大鼠缺血皮质区细胞损伤率比较（，%）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与活血荣络方组比较，#P＜0.05

细胞损伤率14.45±1.88 56.15±5.82*38.91±4.77▲65.65±4.55▲#57.10±4.18#36.14±3.43▲组别假手术组模型组活血荣络方组EX-527组活血荣络方+EX-527组艾地苯醌组只数5 5 5 5 5 5

2.3 活血荣络方对模型大鼠缺血皮质区三磷酸腺苷含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠缺血皮质区ATP含量明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，活血荣络方组和艾地苯醌组大鼠缺血皮质区ATP含量明显增加（P＜0.05），EX-527组大鼠缺血皮质区ATP含量明显减少（P＜0.05）；与活血荣络方组比较，活血荣络方+EX-527组缺血皮质区ATP含量明显减少（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠缺血皮质区ATP含量比较（，μmol/g）

表4 各组大鼠缺血皮质区ATP含量比较（，μmol/g）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与活血荣络方组比较，#P＜0.05

ATP组别 只数8.02±0.75 2.70±0.37*4.77±0.23▲2.04±0.21▲#2.72±0.33#5.11±0.37▲假手术组模型组活血荣络方组EX-527组活血荣络方+EX-527组艾地苯醌组5 5 5 5 5 5

2.4 活血荣络方对模型大鼠缺血皮质区沉默信息调节因子1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，活血荣络方组和艾地苯醌组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α蛋白表达明显升高（P＜0.05），EX-527组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与活血荣络方组比较，活血荣络方+EX-527组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图2、图3、表5。

表5 各组大鼠缺血皮质区SIRT1、PGC-1α表达比较（，平均光密度）

表5 各组大鼠缺血皮质区SIRT1、PGC-1α表达比较（，平均光密度）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与活血荣络方组比较，#P＜0.05

PGC-1α 0.41±0.02 0.22±0.04*0.30±0.02▲0.17±0.03▲0.23±0.04#0.31±0.02▲组别假手术组模型组活血荣络方组EX-527组活血荣络方+EX-527组艾地苯醌组只数5 5 5 5 5 5 SIRT1 0.43±0.08 0.24±0.06*0.38±0.07▲0.15±0.03▲0.28±0.06#0.40±0.07▲

图2 各组大鼠缺血皮质区SIRT1阳性表达（免疫组化染色，×400）

图3 各组大鼠缺血皮质区PGC-1α阳性表达（免疫组化染色，×400）

2.5 活血荣络方对模型大鼠缺血皮质区沉默信息调节因子1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α mRNA表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，活血荣络方组和艾地苯醌组大鼠缺血皮质区SIRT1和 PGC-1α mRNA表达明显升高（P＜0.05），EX-527组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α mRNA表达明显降低（P＜0.05）；与活血荣络方组比较，活血荣络方+EX-527组大鼠缺血皮质区SIRT1和PGC-1α mRNA表达明显降低（P＜0.05）。见表6。

表6 各组大鼠缺血皮质区SIRT1、PGC-1α mRNA表达比较（）

表6 各组大鼠缺血皮质区SIRT1、PGC-1α mRNA表达比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；与活血荣络方组比较，#P＜0.05

PGC-1α 1.79±0.46 0.99±0.11*1.68±0.19▲0.33±0.06▲1.00±0.04#1.70±0.30▲组别假手术组模型组活血荣络方组EX-527组活血荣络方+EX-527组艾地苯醌组只数5 5 5 5 5 5 SIRT1 1.92±0.59 0.97±0.07*1.71±0.11▲0.29±0.02▲0.95±0.08#1.73±0.20▲

3 讨论

荣气兼具气、血、精、津、液等精微物质的生理功能，而荣气虚滞为缺血性中风发病的关键，其根本在于肝肾阴虚，津血暗耗[15]。若内邪聚集、凝结闭塞、气化失职等使脑络不通或络虚不荣，则脑髓神机紊乱、神不导气，脑窍失聪、气机升降失职，阴阳失调，发为中风[16]。活血荣络方基于荣气虚滞理论创立，由石楠藤、鸡血藤、玄参、生地黄、黄精、乳香、没药、川芎组成，具有滋阴生津、活血通络之效。

课题组前期探讨了荣气与线粒体病理生理的相关性，荣气功能在一定程度上体现线粒体的部分功能，相关研究表明，活血荣络方可减轻脑缺血再灌注后线粒体损伤[8-10]。线粒体约占神经元总体积的30%，缺血时脑血流急剧减少，使氧、糖缺乏，线粒体内酶系统（包括呼吸酶和氧化磷酸化酶）活性降低，ATP生成不足，神经元代谢失衡，导致神经元直接坏死或凋亡。同时，酶系统活性降低可使离子通道异常开放，线粒体内钠离子、钙离子增多，引起水钠潴留、钙超载，使呼吸链受损，进一步阻碍ATP生成，加重神经元损伤[17]。再灌注后，受损线粒体无法进行正常氧化供能，其利用氧气时多转化为O2-而生成过氧化物，加重线粒体损伤[18]，形成恶性循环，最终导致神经元广泛坏死或凋亡。本研究表明，能量代谢紊乱存在于CIRI过程中，并进一步导致神经元损伤、死亡，而活血荣络方与艾地苯醌能提高缺血脑组织ATP含量，改善大鼠神经功能缺损症状及病理损伤，提示2种药物可能通过调节能量代谢保护神经元。

SIRT1参与多种基因表达，能感受细胞代谢水平和氧化还原状态，进而激活或抑制多种途径参与能量代谢调节，使机体适应脑缺血应激状态[19]。PGC-1α是参与线粒体呼吸和基因转录的有效刺激因子。SIRT1磷酸化和去乙酰化影响PGC-1α活性，而PGC-1α可通过直接或间接上调线粒体多种相关蛋白表达，诱导线粒体合成，提高能量代谢水平，适应机体脑缺血后应激，维持神经元内稳态[20]。研究发现，SIRT1可去乙酰化下游靶基因PGC-1α，并提高其基因和蛋白表达水平[21]。当细胞能量不足时，SIRT1活性增加，去乙酰化而激活PGC-1α，诱导线粒体生物发生及氧化磷酸化相关基因和蛋白表达，提高线粒体功能，改善能量代谢，提高神经元存活率[22]。本研究表明，活血荣络方能上调缺血脑组织SIRT1、PGC-1α蛋白及mRNA表达，而在活血荣络方基础上使用SIRT1抑制剂EX-527后，SIRT1、PGC-1α蛋白及mRNA表达显著降低，说明抑制SIRT1可以降低活血荣络方的脑保护作用，活血荣络方可能通过激活SIRT1/PGC-1α信号通路发挥保护作用。

综上所述，活血荣络方能促进CIRI后缺血脑组织ATP生成，改善神经功能缺损症状，其机制可能与激活SIRT1/PGC-1α信号通路有关。本研究可为中药防治缺血性脑卒中提供实验依据。