中药复方对断奶幼兔大肠杆菌-魏氏梭菌混合型腹泻的预防效果

吴 婕，蒋诗琪，黄 雨，夏耀辉，任东娜，冯世秀，任战军

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.深圳市南亚热带植物多样性重点实验室，广东深圳 518004)

细菌性腹泻是规模化养殖兔时的多见病[1]，其首要的致病菌为大肠杆菌、魏氏梭菌等兔场常见菌[2]，幼兔感染后发病迅速、症状危急，有极高病死率[3-4]。同时感染多种致病菌的腹泻幼兔病情比单种致病菌型更严重、更难根治[5]。饲粮中添加中药可有效防治兔腹泻类疾病：茜草、白头翁、苦参、马齿苋等主配的复方可防治兔大肠杆菌病[6]，白头翁、生姜、石榴皮、甘草可用于初期治疗兔魏氏梭菌型腹泻[7]。本研究中的中药复方含茜草、白头翁、苦参、马齿苋等均具抗菌消炎、提高免疫力等功效的药材[8-18]，但其防治幼兔大肠杆菌-魏氏梭菌型腹泻的成效亟待考证。

本试验测定幼兔摄入含不同比例中药复方的饲粮，遭遇攻毒后腹泻率、免疫因子水平、盲肠菌群上的差异，探究该复方预防幼兔大肠杆菌-魏氏梭菌型腹泻的效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

致病性大肠杆菌O1、兔致病A型魏氏梭菌由西北农林科技大学动物医学院馈赠。

中药复方由深圳市南亚热带植物多样性重点实验室配伍并提供，组分为：茜草、白头翁、苦参、马齿苋、板蓝根、蒲公英、大青叶、茯苓、苍术、黄连、黄柏。

1.2 动物处理

选择体质量相近、公母各半、健康无病的 (45±2)日龄伊拉幼兔32只，随机分为对照组、攻毒组(Ⅰ)、0.5 % 中药组(Ⅱ)、1.0 % 中药组(Ⅲ)，每组8只，每只记为1重复。试验期第1～7 d，对照组、Ⅰ组幼兔提供基础饲粮；Ⅱ、Ⅲ组分别在饲粮中添加0.5 %、1.0 %中药复方。第8日施以攻毒：对照组腹腔注射8 mL生理盐水，其余各组腹腔注射8 mL菌液(含大肠杆菌、魏氏梭菌各 4×109CFU)，各组饲粮不变。第14日处死存活幼兔，采集脾脏及盲肠内容物。

1.3 盲肠菌群16S rDNA扩增子测序

使用OMEGA E.Z.N.A.○RStoll DNA Kit提取幼兔盲肠菌群总DNA；委托诺禾致源公司，基于IonS5TMXL测序平台进行16S rDNA V4区域的扩增、构建文库及测序。去除原始读取中的嵌合体及低质量读取，并以97%的一致性水平进行OTUs聚类；进行物种注释及丰度分析以比较组间Shannon、Simpson、Chao1、ACE指数与门属优势菌群水平。

1.4 腹泻率的测定

记录各组攻毒后48 h内的腹泻情况。腹泻率=总腹泻天数/(8×总天数)×100%。

1.5 免疫指标的测定

参照兔sIgA、IgA、IgM、hs-CRP酶联免疫试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)步骤，检测各组脾脏以上免疫因子的表达水平。

1.6 数据统计与分析

使用excel 2016对数据进行初步记录归纳；免疫因子水平通过SPSS 21.0进行单因素方差检验(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，并用“平均值±标准差”表示；其他数据使用组内平均值 表示。

2 结果与分析

2.1 中药复方对幼兔肠道菌群的影响

2.1.1 α多样性分析 由表1 可知，各组的净读数在79 586～80 678以内，覆盖度范围在0.92～0.95，表明测序中对各试验组的检测程度一致，并检测出了绝大多数的序列；Ⅰ组的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指数普遍低于对照组，表明腹泻幼兔肠道微生物物种的多样性和丰富度低于健康幼兔；Ⅱ组的α多样性指数均高于Ⅰ组，Ⅲ组的Shannon、Simpson指数高于Ⅰ组，表明中药组幼兔肠道菌群的多样性均高于腹泻幼兔，且Ⅱ组的肠道菌群比Ⅲ组更丰富，体现出更好的治疗效果。

表1 各处理中的测序信息及α多样性指数Table 1 Information of sequencing and α diversity indices under different treatments

2.1.2 门属水平优势菌群的组成与结构 由表 2 可知，各组门水平上的优势菌群以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)为主，占盲肠微生物集落的82.97%～87.40%，这表明各组优势菌门的结构与含量总体相近；Ⅰ组疣微菌门的相对水平显著低于对照组和Ⅱ组(P<0.05)。各组属水平上的优势菌群均为乳头杆菌属(Papillibacter)、Akkermansia属、不明瘤胃菌科(unidentified_Ruminococcaceae)、不明肠杆菌科(unidentified_Enterobacteriaceae)、拟杆菌属(Bacteroides)。在幼兔中，拟杆菌属、Akkermansia属是肠道有益菌群，不明肠杆菌科为有害菌群。与对照组相比，Ⅰ组Akkermansia属的比例显著降低(P<0.05)，不明肠杆菌科的相对含量上升(P>0.05)；Ⅱ组Akkermansia属的相对丰度上升、不明肠杆菌科的丰度降低(P> 0.05)，拟杆菌属的相对含量显著上升 (P<0.05)。Ⅱ组Akkermansia属、拟杆菌属的比例均显著高于Ⅰ组，不明肠杆菌科显著低于Ⅰ组(P<0.05)；Ⅲ组优势菌属的相对丰度普遍处于Ⅰ、Ⅱ组之间的水平。Akkermansia属是疣微菌门的主要菌群，门属菌群水平的丰度分析揭示各组Akkermansia属与疣微菌门一致的变化趋势，同时表明Akkermansia属对维持幼兔的肠道环境稳态、抵御病原体的侵袭有重要意义；Ⅱ组有效改善了有益菌、有害菌的相对水平，相比Ⅲ组更早恢复肠道菌群稳态。

表2 腹泻幼兔盲肠门水平与属水平上的优势菌群相对丰度差异Table 2 Differences in relative abundance of dominant cecum bacteria in diarrheal rabbits at levels of phylum and genus %

2.2 中药复方对攻毒幼兔腹泻率的影响

对照组在48 h内无腹泻幼兔，其余各组均有幼兔表征腹泻。24 h内，Ⅰ组腹泻率为100%；Ⅱ、Ⅲ组腹泻率均为25%；48 h内，Ⅱ 组腹泻率为31.25%，Ⅲ组腹泻率为37.5%，表明中药复方对幼兔大肠杆菌-魏氏梭菌混合腹泻有显著的预防效果。Ⅰ组幼兔在48 h内均死亡；Ⅱ、Ⅲ组腹泻幼兔分别在4、3 d内死亡，表明该中药复方对腹泻幼兔的病情有一定的缓解作用。

2.3 中药复方对腹泻幼兔免疫指标的影响

由表 3可知，Ⅱ组的IgM、SIgA、hs-CRP水平极显著升高，Ⅲ组的IgM、IgA、SIgA、hs-CRP水平均极显著升高(P<0.01)。此外，Ⅱ组的SIgA水平极显著高于Ⅲ组(P<0.01)。该结果表明饲喂中药可显著提升幼兔的免疫能力。

表3 中药提取物对试验组幼兔免疫因子的影响Table 3 Immune factors in experimental groups under different treatments of Chinese herbal medicine μg/mL

3 讨 论

养殖户预防幼兔腹泻的措施常为接种各类疫苗，或饲喂抗生素，前者耗费大量人力物力，后者易因长期滥用抗生素使病菌的耐药性提升，不利于养殖场的长期防疫[19-20]。饲料添加剂“限抗禁抗”迫使人们寻求高效安全的抗生素替代物。本研究选取的中草药均为本土常见药材。中药可通过改变肠道微生物比例达到治疗目的，其机制可为防治幼兔细菌性腹泻提供思路[21-22]。中药复方的活性成分复杂，多为生物碱、酮类等化合物，味微苦，对动物的适口性有一定影响，故在攻毒前有7 d的预饲期供幼兔适应采食[23]。饲粮中添加0.5%、1%的中药剂量在已有研究中证实对动物采食量无显著差异[23]；在本试验前7 d的预饲期中，0.5%、1%中药组幼兔的采食量与对照组和攻毒组相比均无明显变化，表明添加0.5%、1%水平中药的饲粮适口性良好，不影响幼兔的充分采食。

3.1 中药复方对幼兔肠道菌群的影响

盲肠菌群α多样性指数反映肠道微生物的丰度、均匀度、复杂度等信息，其数值越高代表微生物类群的复杂度和多样性越高、肠菌平衡越趋于稳定[24]。健康动物的肠道菌群α多样性指数普遍高于患肠道疾病的动物[25]。在本试验中，攻毒组腹泻幼兔的α多样性指数低于对照组健康幼兔，其肠道状态与腹泻幼兔相符；Ⅱ组的α多样性指数与对照组持平，说明饲粮中添加0.5%中药可更好地改善幼兔的肠道环境。

对照组的门属水平均与前人研究中的幼兔盲肠微生物组成结构相一致[26-27]。拟杆菌属、Akkermansia属是健康宿主肠道附殖的有益菌群：拟杆菌属可分解膳食纤维中的阿拉伯木聚糖，增强宿主的免疫反应；Akkermansia属分解宿主肠道粘膜的粘蛋白，可调节宿主代谢，利于宿主抵御肠道炎症[28-30]。不明肠杆菌科是宿主肠道中的有害菌群，腹泻仔猪肠道菌群中不明肠杆菌科的比例上升[31-33]。在本试验中，腹泻幼兔盲肠菌落中有益菌受抑制，有害菌过度增殖，加剧了肠道环境的失衡；而中药通过调节攻毒幼兔肠道中有益菌和有害菌的比例，有效抵御致病菌的侵袭。

3.2 中药复方对攻毒幼兔腹泻率的影响

构建动物腹泻模型可循肌肉注射、腹腔注射、口服灌注等攻毒手段[34]。腹腔注射菌液后的动物病情发生较早、腹泻程度偏重，与生产中幼兔急性腹泻相似，故本试验结合已有文献与预试验攻毒结果，选择幼兔腹泻率最高、攻毒后24 h内无死亡的攻毒剂量建立大肠杆菌-魏氏梭菌腹泻模型[6,34-35]。Ⅱ、Ⅲ组幼兔的腹泻率远低于Ⅰ组，表明添加两种比例的中药均可有效预防腹泻。

3.3 中药复方对腹泻幼兔免疫指标的影响

IgM是机体防御病原体的第一批“卫士”[36]。SIgA于机体胃肠道、呼吸道等粘膜表面有最高水平，可提升肠粘膜附殖微生物群落多样性、抑制促炎菌群比例[37-40]。SIgA包被断奶小鼠、牛、猪的胃肠道中近70%的共生菌群，增进维持肠道菌群-肠粘膜的稳态[41]。IgA缺陷小鼠免疫系统发生紊乱，对肠道共生菌群亦会产生全身性炎症反应[42]。Hs-CRP是炎性因子刺激时机体响应的超敏C-反应蛋白，常作为急性炎症的标记物[43]。本试验中Ⅱ、Ⅲ组的IgM、SIgA、Hs-CRP水平极显著高于Ⅰ组，且Ⅱ组的SIgA水平极显著高于Ⅲ组，说明饲粮中添加0.5%、1%的中药可有效提升幼兔的免疫能力，且SIgA在两菌混合感染幼兔的过程中起重要抵御作用。

4 结 论

混合感染大肠杆菌、魏氏梭菌的腹泻幼兔盲肠微生物环境被破坏，有益菌的相对含量减少、有害菌的相对含量增加。0.5%水平的中药复方可改善肠道菌群中有益菌与有害菌的水平，提高幼兔的免疫力，预防大肠杆菌-魏氏梭菌型腹泻的效果更佳。