鼻咽癌组织STR基因座变异的研究

马栋棋，杨慧凌，孟洁敏，王韵，徐冬冬,3，杜冰,3

(川北医学院基础医学与法医学院,1.组织学与胚胎学教研室；2.法医物证教研室；3.川北医学院司法鉴定中心，四川 南充 637000)

短串联重复序列(short tandem repeats，STR)又称微卫星DNA，是由2～6个核苷酸组成的简单串联排列的DNA序列，在人群中呈高度多态性，遵循孟德尔遗传规律，具有较强的遗传稳定性。但是，在肿瘤组织中，由于基因组的突变，STR变异的发生率显著高于正常组织。肿瘤组织STR基因座的异常分型主要包括4类[1]，即等位基因增加(additional allele，Aadd)、新等位基因(new allele，Anew)、完全杂合性丢失(complete lost of heterozygosity，LOH)和部分杂合性丢失(partial lost of heterozygosity，pLOH)。多项研究[2-10]表明肿瘤组织中存在STR变异，因此，在肿瘤组织中，采用STR基因座进行个体同一认定时，不能完全照搬以往的评价体系作出肯定或排除的评判结果。

鼻咽癌作为头颈部恶性肿瘤，发病率高，是四川、广东等地区常见的恶性肿瘤之一。本研究选取四川东北地区鼻咽癌组织作为研究对象，采用21个常染色体STR基因座及Amel基因座分型检测，旨在发现鼻咽癌组织中法医学常用STR基因座的变异类型及变异规律。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年9月至2017年8月川北医学院附属医院收治的79例经病理学诊断确诊为鼻咽癌患者的肿瘤组织及其对照组织。本研究经伦理委员会批准，患者均知情同意。患者的肿瘤组织来源于病理科石蜡包埋组织，对照组织为同一个体的外周静脉血。鼻咽癌患者中有61例收集到临床病理资料，包括患者的性别、年龄、临床分期等，其中男性42例，女性19例，年龄20～80岁，服从正态分布，平均年龄50岁。患者临床分期为Ⅰ～Ⅳ期(2008广州分期[11])，其中Ⅰ期1例，Ⅱ期5例，Ⅲ期31例，Ⅳ期24例。

1.2 DNA提取

肿瘤组织基因组DNA提取：采用TIANamp FFPE DNA Kit试剂盒提取石蜡切片组织样本基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

对照组织基因组DNA提取：采用Chelex-100法提取外周静脉血样本基因组DNA，按常规操作步骤进行。

1.3 扩增及电泳

采用AGCU Expressmarker 22复合扩增系统(D2S441、D2S1338、vWA、D3S1358、PentaE、D5S818、D6S1043、TPOX、D7S820、D8S1179、TH01、D10S1248、D12S391、CSF1PO、D13S317、PentaD、D16S539、D18S51、FGA、D19S433、D21S11和Amel性别基因座)对样本DNA进行复合扩增。反应体系10 μL，含模板DNA 2 μL，Reaction Mix 4 μL，EX22 Primers 2 μL，热启动C-Taq酶0.4 μL，sdH2O 1.6 μL。反应体系经95 ℃变性2 min，以94 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s循环10次，再以90 ℃ 30 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s循环18次，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经AB 3500 Genetic Analyzer电泳分型，GeneMapper ID-X软件分析图谱，统计分型结果。

对比同一个体肿瘤组织及其对照组织的STR分型结果，观察鼻咽癌组织STR基因座等位基因的变异情况，出现变异的样本再重复检验1次进行确认。其中，部分杂合性丢失的评判标准以等位基因的峰高或峰面积的比值<0.5或>2.0为准[12]。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计数资料采用[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验；等级资料以频数表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织个体变异统计

通过比较鼻咽癌组织和对照组织的分型结果，79例鼻咽癌组织中有26例发生了STR变异，发生率为32.9%。其中有5例鼻咽癌组织发生Aadd，1例出现Anew，5例发生LOH，25例发生pLOH。其中，Aadd、Anew、LOH等三种变异可导致STR基因型改变[13](STR genotype alteration，STRGA)，本研究鼻咽癌组织STRGA的发生率为8.9%。同一个体可同时发生多种类型STR变异。见表1。

表1 鼻咽癌组织STR变异类型的发生率

2.2 鼻咽癌组织STR基因座变异统计

经21个常染色体STR基因座及Amel基因座的分型检测，鼻咽癌组织中有19个STR位点发生了变异。其中，Penta E、D2S441、TPOX、D2S1338、Penta D、D10S1248、D5S818等7个位点只发生了pLOH，未引起基因型改变。D3S1358、D13S317、D16S539、TH01、CSF1PO、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D12S391、FGA等12个STR基因座的变异导致基因型发生了改变。出现变异次数最多的基因座是D3S1358，共发生了12次变异，包括两次LOH和10次pLOH。D7S820、D19S433和Amel基因座未发生变异。同一个体多个基因座可同时发生变异。见表2。

表2 79例鼻咽癌组织中等位基因变异统计

续表2

2.3 鼻咽癌组织STR变异在性别、年龄、临床分期的分布

61例鼻咽癌患者临床病理资料中，STR变异在性别、年龄、临床分期的分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，即鼻咽癌组织STR变异与患者的性别、年龄、临床分期等资料无明显相关性。见表3。

表3 鼻咽癌STR变异结合临床资料的分析[n(%)]

2.4 STR变异图谱示例

STR变异图谱示例见图1-图4。

3 讨论

现代肿瘤学说中，癌症是在分子水平出现多次的遗传学改变，肿瘤组织STR变异是遗传不稳定性的体现。本研究发现，鼻咽癌组织STR变异的发生率为32.9%。变异类型包括Aadd、Anew、LOH、pLOH，其发生率分别是6.3%、1.3%、6.3%、31.6%。其中，Aadd 、Anew 、LOH等三种变异会导致基因型发生改变，对DNA鉴定结果产生影响。此外，本研究中鼻咽癌组织STRGA发生率是8.9%，因此涉及该类肿瘤组织的DNA检案鉴定，出现个别位点基因型不匹配时，宜慎重下排除结论。不同肿瘤组织中STR变异存在差别。Li等[14]在结直肠癌组织中发现STR变异的发生率分别是Aadd 0.89%、Anew 0.57%、LOH 0.89%、pLOH 8.93%；李璐等[15]报道甲状腺乳头状癌组织中STR变异的发生率分别是Aadd 0.11%、Anew 0.74%、LOH 0.32%、pLOH 1.17%；Zhang等[16]在肺癌组织中发现3种变异类型，其发生率分别是Aadd 13.3%、LOH 13.3%、pLOH 46.7%。肿瘤组织中Aadd、Anew的发生率较低，pLOH发生率较高，这可能与它们的发生机制不同有关。另外，肺癌组织STR变异发生率较高，鼻咽癌STR变异发生率次之，结直肠癌、甲状腺乳头状癌组织STR变异发生率较低，提示不同肿瘤组织的基因组稳定性可能存在差异。

本研究选取的22个STR位点有19个发生了变异，其中变异次数最多的STR基因座是D3S1358，与既往研究[17-18]结论一致，钟巧娥等[17]在人肺癌组织STR变异的研究中发现，变异次数最多的基因座是D3S1358和CSF1PO；Poetsch等[18]在四种不同类型肿瘤中发现，D3S1358、D21S11、D18S51和FGA基因座表现了较高变异率。D3S1358的变异率较其它位点高，提示D3S1358在肿瘤组织中稳定性较差，不适合用于肿瘤组织的个体识别及亲权鉴定。张相国等[19]对广东地区鼻咽癌组织的分型检测中发现，D18S51和D16S539等2个基因座发生了微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)，MSI的发生率为7.3%。本研究D18S51、D21S11、CSF1PO、D6S1043、D8S1179等5个位点发生了MSI，MSI的发生率为7.6%，且D16S539基因座的变异类型是LOH和pLOH，这与张相国等[19]的报道不同。分析原因可能是与研究对象的地域、遗传背景、样本数量、选用的STR位点等不同有关。本研究中，D7S820、D19S433和Amel基因座未发生变异，提示其在鼻咽癌组织中的稳定性较好，后续可扩大肿瘤样本量及样本类型，探究其在肿瘤组织DNA鉴定中的应用价值。

另外，本研究检测用的STR位点有19个均发生了变异，且STR变异与鼻咽癌患者的性别、年龄、临床分期等无明显相关性，与既往研究基本一致。张相国等[20]研究MSI与鼻咽癌的临床相关性时也发现，鼻咽癌MSI的发生与患者性别、年龄、临床分期等无显著相关性。然而，Zhang等[16]、马若翔等[21]在肺癌组织中的研究报道称，STR变异与患者的年龄及肺癌的分期有关，年龄越大，进展期越深的患者变异频率越高。Zhen等[22]对甲状腺乳头状癌的研究发现，STR变异与患者的性别无关，但与患者的年龄有显著的相关性。因此，尽管此类STR位点处于非编码区，但在某些肿瘤组织中其变异仍然可能与疾病存在关系，具有一定的临床探究价值。

综上，鼻咽癌组织中STR基因座变异与患者性别、年龄、临床分期等无明显相关性。鼻咽癌组织中D3S1358基因座的变异率高，而D7S820、D19S433和Amel基因座未发生变异。