ε-聚赖氨酸的抑菌机理及其在肉制品复合保鲜中应用研究进展

赵晓蕊，李荣辉，蔡小雨，李鹏阳，魏秋妍，崔玉晴，李利，王震

（河北农业大学 理工学院，河北 沧州 061100）

随着人们生活水平的提高，对肉制品的品质要求也日益提高。肉制品在加工、运输、贮存过程中容易受到腐败病原菌的污染，使产品的感官品质、营养价值降低，并且容易导致食物中毒[1-2]。传统的肉制品保鲜技术主要包括冷冻保鲜、高温灭菌保鲜、真空保鲜、化学保鲜等。冷冻保鲜需要大型冷藏、冷库等设施，同时，冻干后的肉品嫩度、保水性等指标也有所下降；高温灭菌保鲜会对肉制品的风味和品质产生不利的影响；真空包装对食品的包装要求很高，同时也会影响肉制品的外观品质；化学保鲜剂，如山梨酸及其钾盐、苯甲酸钠、过氧乙酸等，不仅会对肉类品质造成不良影响，而且过度使用会导致食品安全问题[3-5]。因此，寻求绿色、安全、高效的肉类防腐保鲜技术已成为当今肉类加工行业的研究热点之一。

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是由白链霉菌在葡萄糖基质中发酵而得的一种天然的抑菌剂，具有无毒、安全、生物可降解性、广谱性强、稳定性高等优势，被广泛用于食品、医药、电子等领域的保鲜，特别是对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等具有很好的抑菌效果[6-7]。现阶段，美国、日本、韩国、中国等国家已经通过了ε-PL的安全认证。我国的ε-PL工业化生产已有一定的规模，但是由于当前产品的使用范围比较小，产业化规模尚未得到充分的发展。近年来，将ε-PL与其它复合保鲜技术结合起来，逐渐形成了一种新型的防腐保鲜手段，并有望在今后的应用中取得新的进展。本文就ε-PL的抗菌保鲜技术的研究进行综述，重点介绍ε-PL的抑菌机理以及各种复合技术在肉类保鲜中的最新进展，以期为ε-PL的高效、绿色保鲜技术的深入开发提供借鉴。

1 ε-聚赖氨酸的抑菌研究

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种由25个～35个 L-赖氨酸残基通过α-氨基与ε-羧基缩合成酰胺键形成的物质，分子式为C180H362N60O31，分子量为3 600 Da～4 300 Da，对pH值、热均比较稳定，具有较强的抗菌活性，可有效地抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌[8-11]。ε-PL具有良好的安全性，对人体神经系统、免疫系统、生殖系统及婴儿发育无不良作用，而且ε-PL是一种很好的可降解物质，可以在体内分解成赖氨酸，为人体所需[11]。

1.1 ε-聚赖氨酸的抑菌活性

ε-聚赖氨酸使用环境与天然防腐剂——乳酸链球菌（Nisin）相似，其抗菌作用范围较广，尤其是对大肠杆菌、节杆菌等有较强的抗菌活性[12-13]。李诚等[14]通过分光光度法、孔扩散法、菌体法，对ε-聚赖氨酸的抑菌作用进行了探讨，结果表明，ε-聚赖氨酸的抗菌活性随着浓度的增大而增大，其抗菌性能也较好，在pH5～8时抑菌作用最大，与甘氨酸、Nisin等具有协同抑制作用。时文静等[15]用结晶紫法检测表明，鲍曼不动杆菌在ε-PL中生成了大量的活性氧（reactive oxygen stke，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），并且 ε-PL对鲍曼不动杆菌的生长及膜的形成具有明显的抑制作用。吴旻[16]以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，通过对pH值、温度、金属离子等条件进行考察，研究ε-PL的抑菌效果，结果发现，温度对ε-PL的抑菌活性影响较小，pH值在酸性和微碱的条件下，ε-PL对受试菌具有很好的抑制能力，而Zn2+对ε-PL的抑菌能力有增强效果。

1.2 ε-聚赖氨酸的抑菌机理

目前，ε-PL的抗菌主要机制可通过毡毯模型，也就是膜冲击作用进行解释[17-19]。该理论认为，ε-PL通过静电吸附和细胞膜表面磷脂头部结合时，会像毡毯一样覆盖在细菌膜表面，随着ε-PL浓度的增加，达到一定的阙值时，ε-PL平行于膜表面慢慢积聚并形成一个快速交换的孔洞，让更多的ε-PL进入到细菌内部，疏水基团朝向磷脂侧，亲水部分面向溶液，最终随着ε-PL的不断侵入，细菌最终被分解与ε-PL融合形成微胶团，失去生物活性。该行为属于物理行为，目前，对ε-PL的抑菌机制的研究主要有以下3个方面：（1）ε-PL对细胞膜的影响，干扰细胞的能量、物质和信息的传输；（2）ε-PL对功能性蛋白质或主要酶的影响，导致能量代谢障碍；（3）ε-PL对基因的影响，导致DNA的破坏。ε-聚赖氨酸的抑菌机理如图1所示。

图1 ε-聚赖氨酸（ε-PL）的抑菌机理Fig.1 Antibacterial mechanism of ε-polylysine

1.2.1 ε-PL对细胞膜的破坏

细胞膜是一种与细胞内、外环境相隔离的重要屏障，它不仅能有效地吸收养分，而且还能排出体内的代谢废物。根据毡毯模型原理，ε-PL是利用静电吸附的方式黏附于细胞膜，二价阳离子取代了磷脂头，导致细胞膜产生负曲率折叠，细胞膜的完整性和结构被破坏，最后引起细胞死亡[20]。王梓源等[21]研究证实，ε-PL对大肠杆菌（E.coli）细胞的疏水性及细胞内、外膜的透过率均有促进作用。它能通过对细胞膜的侵袭，使其结构与完整性受到损害，改变细胞内和外膜的电位，导致细胞内的核酸、蛋白质等大量排出，达到抑制大肠杆菌的作用。Zhang等[18]采用紫外、膜电位和流式细胞术测定了膜完整性，采用β-半乳糖苷酶活性检测法检测内膜的通透性，结果证实，低浓度的ε-PL（16 μg/mL）可影响大肠杆菌 O157:H7（Escherichia coli O157:H7）细胞膜的穿透和完整性，造成细胞的死亡，并且随着ε-PL浓度的增大，细胞膜损伤越严重。闫亚芳[22]研究发现ε-PL通过清除部分成熟的生物膜，可以有效抑制非白色念珠菌浮游菌的生长和生物膜的形成，达到抑菌的目的。周祺等[23]通过研究发现，ε-PL主要是通过改变细胞膜的通透性和改变细胞内的电位，使核酸、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等物质大量排出，并与DNA结合，达到杀灭肠球菌的目的。蓝蔚青等[24]阐述了ε-PL对腐生葡萄球菌的作用机制：ε-PL能改变其细胞膜的结构和通透性，从而影响呼吸通道中的酶和微生物的生长代谢，从而破坏微生物的整体结构，从而导致真菌的死亡。Li等[25]研究发现，ε-PL对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为 12.5 μg/mL，当 ε-PL 浓度升高时，细胞膜被破坏的深度愈深，细胞中的离子会漏出，从而起到抑菌的作用。并采用结晶紫法和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）对沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌的生物膜生成速率进行分析，结果表明，在ε-PL的影响下，其最小抑菌浓度为10.36%、9.10%、17.44%、21.37%。同时，ε-PL也可以通过改变酵母的膜结构和功能来实现对微生物的抑制。Bo等[26]研究了ε-PL对酿酒酵母的抑制效应，并对其机理进行了初步研究。高浓度的ε-PL能破坏酿酒酵母的细胞膜，导致其死亡；低浓度的ε-PL能对酿酒酵母的细胞膜产生影响，从而影响其功能，达到抑制酿酒酵母的生长的目的。上述研究结果显示，ε-聚赖氨酸是一种很有潜力的天然食物防腐剂。

1.2.2 ε-PL对功能蛋白或酶的破坏

糖酵解和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）是一种在有氧生物中普遍存在的代谢过程，是体内必需的能量来源。已有研究发现，ε-PL能抑制细菌的糖酵解和三羧酸循环途径，从而对其代谢产生一定的影响，并导致细菌的死亡[27-29]。ε-PL对腐败希瓦氏菌的抑菌作用示意图如图2所示。

图2 ε-PL对腐败希瓦氏菌的抑菌机理示意图Fig.2 Schematic diagram of the inhibitory mechanism of ε-polylysine against Shewanella putrefaciens

邢蓓[30]结果显示，在ε-PL的影响下，金黄色葡萄球菌糖酵解和三羧酸循环中主要酶（例如己糖激酶、顺乌头酸、丁二酸）酶活性均明显下降，并与其浓度呈正相关。相似的研究，宁亚维等[31]以金黄色葡萄球菌为指标，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，观察到在ε-PL中，蛋白条带整体呈淡灰色，说明ε-PL可以抑制大分子的合成，也可能是使大分子蛋白分解成小分子蛋白。同时，ε-PL还能在一定程度上抑制细菌的呼吸防御酶。蓝蔚青等[24]通过试验证实ε-PL对腐生葡萄球菌三羧酸循环过程中的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶有明显的抑制作用，并通过改变细胞的电子转移和呼吸过程，使细菌的新陈代谢活动受到抑制，最终导致细菌的死亡。另外，还有部分学者以腐败希瓦氏菌为指示菌，如Lan等[32]对ε-PL的作用进行了初步探究。结果表明，随着ε-PL浓度的升高，过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、琥珀酸脱氢酶（succinodehydrogenase，SDH）和苹果酸脱氢酶（malic dehydrogenase，MDH）活力降低，并且存在浓度依赖性，使糖类物质的代谢受到抑制，从而影响细胞的正常发育，造成细胞的死亡。

1.2.3 ε-PL对遗传物质的破坏

大量的研究显示，ε-PL可以通过对基因微粒或基因材料的结构产生影响，使微生物产生氧化应激反应，使DNA等重要的大分子受到氧化损害，进而诱导细胞凋亡。Ye等[17]研究结果表明，在ε-PL的作用下，大肠杆菌O157:H7与氧化还原反应有关的基因（sodA）和抗氧化系统调控因子（oxyR）的表达均明显升高；ε-PL对DNA破坏效应的调节基因（recA）和抑制蛋白基因（lexA）的表达也有显著的影响。周祺等[23]通过对肠球菌的研究，结果发现，ε-PL具有较强的DNA结合能力，能够破坏DNA，进而影响DNA的复制、转录，最终导致肠球菌的死亡。此外，Tan等[20]结果表明，ε-PL可以使ROS在酵母细胞内大量积累，使DNA片段化，从而影响菌体的表达，进而导致细胞死亡。

2 ε-聚赖氨酸复合保鲜技术在肉制品保鲜中的应用

ε-PL作为一种新型的防腐剂，已被广泛地用于肉类产品的防腐和保鲜。许多学者在探索ε-PL的抑菌作用的同时，也对ε-PL与其它保鲜剂或保鲜技术的联合应用进行了研究。充分利用各种保鲜技术的协同作用可以更好地防止肉类变质，有效保证肉制品的品质和质量。本文系统地总结和梳理了近几年基于ε-PL的复合保鲜技术，主要包括ε-PL复合保鲜剂、ε-PL与复合涂膜保鲜技术、ε-PL与纳米纤维材料复合保鲜技术在肉制品中的应用。

2.1 基于ε-聚赖氨酸的复合保鲜剂

复合保鲜剂是指以2种或2种以上的防腐保鲜剂相结合对食品进行保鲜。ε-PL复合保鲜剂在肉制品中具有广泛的应用。ε-PL常与天然多糖类（如壳聚糖、海藻糖）、其他抗菌肽（如纳他霉素、Nisin）、酚类物质（如荨麻、茶多酚）等联合发挥抑菌功效。莫树平等[33]研究了以ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、纳他霉素复合的新型保鲜剂对广式腊肠的防腐效果，研究表明，该复合防腐剂可显著降低挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的积累和pH值的上升，与国家标准相比，菌落总数远低于国家规定的二级鲜肉标准。岳喜庆等[34]以ε-聚赖氨酸、壳聚糖、双乙酸钠、乙二胺四乙酸4种保鲜剂复配，并通过正交试验进行优选，分别添加 0.01%ε-PL、0.80%壳聚糖、0.30%双乙酸钠、0.01%乙二胺四乙酸，对冷却猪肉进行保鲜，在此条件下贮藏时间可长达16 d。黄艳梅[35]以ε-聚赖氨酸0.015%、Nisin 0.015%、海藻糖4.5%作为复合保鲜剂应用在低温酱卤肉中，使得其保藏期延长至30 d。此外，袁秋萍等[36]以ε-PL、甘氨酸、可食乙醇为原料，对牛肉干进行防腐保鲜，其作用明显，既延长了保质期，又改善了风味。Alirezalu等[37]采用ε-聚赖氨酸与荨麻提取物对牛肉进行保鲜，与对照组相比，其复合保鲜剂可显著抑制霉菌、酵母、总活菌以及大肠杆菌的生长，大大延长了牛肉的保质期，并且不会对其感官品质造成负面影响。尹秀莲等[38]采用ε-聚赖氨酸、茶多酚和壳聚糖3种天然防腐剂处理冷鲜鸡肉，添加量分别为0.36%、0.30%、0.16%，在此条件下，对冷鲜鸡肉的保鲜效果最好。以上结果均表明，采用ε-聚赖氨酸复合保鲜剂在延长货架期和抑制微生物生长方面优于单独使用某种保鲜剂，因此，ε-聚赖氨酸复合保鲜剂具有良好的肉制品保鲜应用前景。

2.2 基于ε-聚赖氨酸的复合涂膜保鲜技术

基于ε-聚赖氨酸的复合膜保鲜技术近几年来是保鲜防腐领域的研究热点，包括可食性复合涂膜和不可食性复合涂膜。可食复合涂层是在天然高分子聚合物如可食性多糖和蛋白质中加入可食性交联剂或增塑剂，以直接或间接的方法在食物的表面形成一种薄膜，起到隔绝空气、水分及微生物的作用，达到防腐保鲜的作用，同时可以搭载功能活性成分，从而达到食品保鲜的目的，具有绿色、安全、低成本、可食用等特点；不可食性复合涂膜则相反，目前常用的材料为聚乙烯醇[39-40]。表1总结了近几年基于ε-聚赖氨酸的复合涂膜保鲜技术在肉制品中的应用研究。

表1 基于ε-聚赖氨酸的复合涂膜保鲜技术在肉制品中的应用研究Table 1 Application of ε-polylysine-containing composite coating in the preservation of meat products

2.3 基于ε-聚赖氨酸与纳米纤维材料复合保鲜技术

近年来，新的纳米纤维已经被应用到了食品的生产中。如Liu等[52]通过将ε-PL掺入明胶/壳聚糖基聚合物，制备了一种有效的抗菌纳米纤维薄膜，用作食品包装材料，显著降低了6种食源性病原体的风险。近几年，静电纺丝技术是一种经济、实用、有前途的新型技术，也是一种新型的、具有应用价值的制备新型纤维材料的途径。在食品保鲜剂中，将抗菌材料包覆于纳米纤维上，可制备出具有生物活性的纳米纤维。在最新的报道中，李可儿等[53]通过静电纺丝工艺，研制出了一种新型的抗菌纳米纤维薄膜——醋酸纤维素/聚乙烯吡咯烷酮/ε-聚赖氨酸（cellulose acetate/polyvinylpyrrolidone/ε-polylysine，CA/PVP/ε-PL） 抗菌纳米纤维膜，用于生鲜肉的保鲜，可延长其保鲜藏期达3 d以上。唐志敏等[54]成功将ε-PL负载到含有海藻酸钠和聚乙烯醇的混纺纤维膜中，研究证实，该纳米纤维复合材料对耐药金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有一定的抑制作用。代娅婕[55]以明胶为基材，将ε-PL包裹于百里香精油（thyme oil，TEO） 和β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）中，可以得到 TEO/β-CD 型聚赖氨酸明胶纳米纤维，对新鲜鸡及新鲜猪肉中的空肠弯曲杆菌的生长有明显的抑制作用。Lin等[56]采用静电纺丝法制得的明胶-甘油-ε-PL纳米纤维对牛肉制品中单增李斯特菌具有明显的抑制作用。以上研究均表明，ε-PL与纳米纤维膜复合保鲜技术在肉制品保鲜领域中的巨大潜力，因此，今后的研究热点应更加关注ε-PL纳米纤维材料在其他食品中的开发。

3 总结与展望

ε-PL是一种天然高效的天然保鲜剂，它能有效地抑制肉类中的腐败细菌。在一定程度上保持肉类产品的优良品质，并能维持产品的新鲜度，从而延长产品的保质期。但是，单一的ε-PL保鲜剂对肉类保鲜性能的影响仍然有限，随着对ε-PL的进一步研究，将ε-PL与其它复合保鲜剂、复合涂膜、复合纳米纤维等保鲜技术相结合，可以获得更好的保鲜效果。近年来，以ε-PL为基础的复合保鲜剂及复合薄膜已被广泛应用于肉类食品的保鲜中，而与某些新型保鲜技术的结合则很少。另外，ε-PL在某些微生物如细菌、真菌等方面的抑制机理研究还不深入，特别是核酸和蛋白质方面的研究很少。因此，今后的研究重点应集中在以下几方面：进一步加强ε-PL抑制细胞机制的深层研究，特别是对细胞的抗性、毒理学、细胞内容物核酸、蛋白质等生物学特性的研究具有重要意义；进一步研究ε-PL与其他保鲜技术的协同效果，尤其是与包装材料、节能保鲜剂的复合技术，以便生产出更适合于肉制品的绿色、安全、高效、经济的复合保鲜剂；在产品应用上，如何充分利用ε-PL的特性，还需要进一步研究。