口腔黏膜上皮培养与眼表移植的研究进展

龚丹妮 综述 严晨曦 傅瑶 审校

上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科 上海市眼眶病眼肿瘤重点实验室,上海 200011

角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)位于角膜缘上皮基底层,可分化为短暂扩增细胞并迁移成为成熟的角膜上皮细胞,以维持角膜表面的完整性。先天性、创伤性或免疫性损伤,如热化学烧伤、Stevens-Johnson综合征、眼部瘢痕性类天疱疮等可导致角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency,LSCD),从而导致反复的上皮糜烂、持续的角膜溃疡、慢性炎症、角膜血管化及纤维化等问题,严重影响患者的视觉功能及舒适感[1]。在治疗单侧LSCD病例中首选体外培养的对侧健康眼LSCs移植;当双眼受影响时,可使用同种异体角膜缘组织。然而,鉴于长期免疫抑制治疗的需要及其可能产生的不良反应,需考虑使用非角膜缘源性自体上皮组织。在过去的十多年中,体外构建培养的自体口腔黏膜上皮细胞(cultivated oral mucosal epithelial cells,COMECs)已成为眼表重建的重要细胞来源,并被广泛证明具有良好的临床效果。本文综合近年来利用培养的口腔黏膜上皮移植(cultured oral mucosal epithelial transplantation,COMET)治疗LSCD的研究进展,对体外培养方式的关键影响因素及细胞片临床移植疗效进行综述。

1 口腔黏膜上皮的体外培养

1.1 培养载体

细胞片的成功培养在很大程度上依赖于载体质量。有效载体应具有高度的生物相容性、非炎症性及非免疫原性,需维持角膜透明度和机械稳定性,并能促进细胞的黏附和增生。目前,多种生物及合成载体已应用于研究。

1.1.1羊膜 人羊膜作为生物材料,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血管生成、促上皮化等特性,是LSCD治疗中应用最广泛的载体。在羊膜上培养的COMECs表现为复层上皮,可检测到非角化复层上皮标志物CK3、CK4/13,部分研究报告了上皮祖细胞标志物p63的表达,透射电镜可见桥粒、半桥粒和紧密连接等结构,与正常角膜上皮相似[2]。目前,对于羊膜载体是否应剥离上皮存在争论。去上皮羊膜具有较低的免疫原性,有利于所培养上皮细胞的迁移和融合,且可促进细胞分化,而完整羊膜更有利于干细胞表型的维持[3-4],二者均可成功培养出口腔黏膜上皮细胞片,但前者在研究中的使用更为频繁。值得注意的是,羊膜制备方法和批次间的可变性、疾病传播的风险、制备的高成本等缺点均可影响培养,因此需寻找替代的载体材料。

1.1.2纤维蛋白载体 纤维蛋白成本较低,支持上皮细胞生长,且可通过抗纤溶药物控制降解,因此已作为载体被广泛用于再生医学。纤维蛋白凝胶是由凝血酶、纤维蛋白原和氯化钙组成的止血复合物,可抑制纤维化、组织坏死及炎症。在体内,凝胶可被完全吸收,有利于细胞片的直接移植,且可减少移植后新生血管的形成。Sheth等[5]的研究表明,在纤维蛋白凝胶上培养的COMECs可形成复层上皮,细胞片表达CK3、CK4/13,且高表达p63。Hirayama等[6]在培养过程中通过添加抑肽酶等蛋白酶抑制剂来防止纤维蛋白降解,并在培养完成后利用纤维蛋白的可降解性分离得到无载体细胞片。纤维蛋白已取得良好的临床效果,但存在一定的安全问题,如术后的病毒传播风险。

1.1.3胶原蛋白载体 人角膜的主要成分是胶原,而胶原蛋白具有天然的生物相容性和低免疫原性,可作为上皮细胞扩增的载体。Ilmarinen等[1]将Ⅳ型胶原蛋白应用于COMECs的培养,在无血清和3T3饲养细胞的条件下,在Ⅳ型胶原涂层培养皿中培养出了复层上皮,结果显示CK3/12、CK4/13呈阳性,基底层细胞表达增生标记Ki67和祖细胞标记p63;此外,培养物显示紧密连接蛋白ZO-1和occludin阳性以及高跨上皮电阻值,表明其具有良好的屏障功能。Petsch等[7]分析了非交联和紫外线/核黄素交联Ⅰ型胶原膜用于角膜表面重建的适宜性和生物相容性,实验证明胶原膜适合作为COMECs生长载体,且在体内显示出高度的生物相容性,为COMET提供了新方案。

1.1.4温敏性培养皿 所有人或动物来源的载体,包括纤维蛋白和胶原蛋白,都有可能造成感染,而温敏性培养皿可避免此问题。培养皿表面共价偶联的温度敏感性聚合物,可随温度变化在亲水与疏水状态间转换,使细胞片自发从皿底分离。获取的COMECs细胞片基底侧细胞间连接及细胞外基质完整,可增强与受体角膜表面的黏附。研究表明,培养的COMECs高表达E-钙黏蛋白,有利于促进细胞黏附并形成眼表的保护性屏障[8]。移植到重度LSCD兔模型角膜的COMECs可促进角膜表面的上皮化,同时可减少病变角膜的血管化和纤维化[9]。此外,COMECs在LSCD患者的临床治疗中也取得了良好的疗效[10]。

1.1.5接触镜 作为合成支架,接触镜在上皮细胞的培养及转移中具有实用性。Björkblom等[11]首次将接触镜用于COMECs的培养,细胞在培养3 d后存活率高,可见融合的鹅卵石样形态,且p63、ABCG2表达呈阳性。Zsebik等[12]实现了在无动物源性材料和饲养层条件下人口腔黏膜组织块在接触镜上的培养,同样得到了理想的细胞片。接触镜培养得到的复层上皮有利于增强对感染的抵抗力,并具有较高的机械强度来耐受手术中的各项操作。由于细胞转移至裸露角膜后还需重新排列,当前对于最佳的细胞培养层数尚未达成共识。

1.1.6新型培养载体 随着研究的进展,许多新型载体在COMECs的培养中得到了研究。Wang等[13]以脱细胞猪角膜基质(acellular porcine corneal stroma,APCS)为载体培养了功能性COMECs,细胞片表达上皮细胞及干细胞标记,且APCS移植有望成为深层角膜病变行板层角膜移植的良好替代品。以离体角膜为载体进行口腔黏膜上皮片的移植培养,结果表明上皮细胞可向角膜表面迁移生长,从而实现角膜的再上皮化[14-15]。Irani等[16]使用多孔硅膜装载COMECs重建干细胞龛,多孔硅膜具有生物相容性,可通过表面修饰来促进降解和细胞附着,并且可以装载蛋白质和生长因子。多孔硅支架上扩增得到的COMECs形态及表型良好,并可成功移植至活体大鼠眼内。Yazdani等[17]则对透明质酸水凝胶支架进行了优化,通过Ⅳ型胶原涂层促进干细胞附着,培养得到的COMECs细胞片可用于眼表重建。新型培养载体为COMECs的培养提供了新的方式与研究思路,但仍需进一步进行临床试验以证明其可行性。

1.2 培养条件

除培养载体外,能提供适宜生长因子的培养条件也十分重要。COMECs标准培养条件通常需要小鼠来源3T3饲养层和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),但为了避免污染,无动物源性成分的培养条件也得到了大量研究。

1.2.1饲养层 3T3饲养层可促进表皮干细胞的长期存活和连续扩增,因此广泛应用于COMECs的培养。考虑到动物源性感染或未知病原体的传播风险,各种人类来源饲养细胞,如真皮成纤维细胞、骨髓间充质干细胞和结膜成纤维细胞,已作为替代细胞应用至研究中。最新的研究表明,人角膜缘龛细胞(limbal niche cells,LNCs)也是一种优良的饲养细胞。作为角膜缘龛的主要成分,LNCs具有间充质和胚胎干细胞的表型特征,可支持LSCs的自我更新,且在兔模型中证明可有效预防LSCD[18]。与培养的角膜上皮细胞相比,COMECs在3T3饲养层的存在下会表达更多的促血管生成因子,而LNCs可降低COMECs的血管生成潜能[19-20]。研究表明,外泌体miRNAs介导的细胞间信号转导可能是LNCs滋养的COMECs抑制血管生成的重要因素,其具体机制有待进一步研究[21]。此外,大鼠LNCs可在体外诱导COMECs转分化,使其形成角膜上皮样细胞,并表达角膜特异性标记CK12和Pax6。

1.2.2血清 除饲养细胞外,FBS是COMECs培养过程中促进其黏附和增生的关键成分。使用FBS同样具有感染的风险,而自体血清可避免这种问题。研究表明自体血清在培养过程中对于上皮细胞未分化状态的维持要优于FBS[4]。Ang等[22]发现添加自体血清的培养基能有效促进COMECs的增生,并成功将细胞片应用到了临床。此外,人血小板衍生物PLTMax也已作为FBS替代物应用于COMECs的培养,PLTmax的添加能促进分离细胞的黏附,取得了良好的实验结果[23]。

1.2.3无血清无饲养层培养体系 尽管饲养细胞和血清的使用极大促进了上皮细胞片的研究,但微生物感染的可能性以及培养方案难以标准化,均阻碍了培养系统的广泛使用,而开发无血清无饲养层的培养体系成为理想的选择。Ilmarinen等[1]在不使用血清和3T3饲养细胞条件下,利用Ⅳ型胶原包被的培养板成功培养了COMECs细胞片。Nakamura等[24-25]利用添加了多种生长因子的DMEM/F12和defined K-SFM混合培养基,培养出包含全克隆型干细胞的功能性COMECs,并成功移植到兔角膜表面。Dhamodarn等[26]将上皮组织置于去上皮羊膜上,在含有自体血清的人角膜上皮生长培养基中进行组织块培养,结果显示该方案可促进COMECs向角膜细胞系分化。Oliva等[27]则使用添加了牛脑垂体提取物的DMEM/BEGM混合培养基,发现COMECs融合并形成复层片状细胞片,且形态和表型与使用血清和饲养层的对照组相近。由此可见,无血清无饲养层培养体系具有广阔的应用空间,今后应进一步探索最适宜的COMECs标准化培养条件。

1.3 培养技术

除载体和培养条件外,培养中涉及到的各项技术也对上皮细胞片的质量至关重要。良好培养技术的运用可减少组织的取材量,提高细胞片的机械性能,且可将细胞片保存再利用,为基础研究及临床应用提供便利。

1.3.1酶解法与组织块培养法 目前,口腔黏膜上皮细胞片的培养主要有酶解法和组织块培养法,其中酶解法的使用更为广泛。酶解法使用单细胞悬浮技术,将口腔黏膜组织用中性蛋白酶Ⅱ以及胰蛋白酶-EDTA处理成单细胞后播种于培养基,经培养使其形成细胞片。Hsueh等[23]发现利用胶原酶分离细胞可保留上皮基底膜,而细胞与基底膜间的相互作用可调节细胞增生。Rovere等[28]则将胶原酶运用于细胞片与培养皿的分离,认为其可提供具有足够抗性及黏附性的COMECs。

由于细胞片的制造需要将细胞高密度播种,而大面积切除口腔黏膜组织会导致严重的口腔疼痛、不适及瘢痕。与酶解法不同,组织块培养法将组织碎片接种于培养皿,上皮细胞从碎片边缘迁移并增生,可产生足够数量的上皮细胞,因此仅需少量供体组织即可培养为上皮细胞移植物应用于再生医学。Morino等[29]在角质形成细胞培养基中进行原代组织块培养,再用胰蛋白酶-EDTA进行处理后将细胞播种在温敏性培养皿中,传代后通过降温获取无载体细胞片。实验表明利用组织块培养法得到的细胞片与酶解法无明显差异,而前者的高播种密度增加了细胞片的获取成功率,并缩短了所需的培养时间。

1.3.2气-液界面培养法 气-液界面培养法是一种通过降低培养基高度,使细胞暴露于空气从而促进其分化及分层的技术,可增加细胞片的机械强度。这种方法在LSCs的培养中得到了很好的研究,并运用于大多数的COMECs培养。与非气-液界面培养得到的2～5层COMECs细胞片相比,气-液界面培养下可获得4～9层的复层细胞片[30]。而当前对于此方法的应用仍存在争议,赞同的观点认为其可促进细胞的迁移、增生、上皮分层并增强细胞的屏障功能,反对的观点则认为其可诱导鳞状化生并使干细胞逐渐损失及分化[2]。因此,在使用COMECs进行角膜再生时,气-液界面培养技术的潜在优势是否大于劣势还有待研究。

1.3.3冻存再培养技术 在LSCD治疗期间,冻存技术有利于组织或细胞的保存以备再次手术的需要。Promprasit等[31]将混合了DMSO、丙二醇及FBS的DMEM作为冻存剂,通过高浓度冻存剂和高降温速率结合的玻璃化冷冻过程来减少渗透和有毒有害影响。该研究将组织冻存2个月后复苏再培养,结果表明冻存组织培养片的干细胞和分化细胞的形态及标志表达与新鲜组织相似,但培养上皮片移植的结果仍有待深入研究。Morino等[29]使用CELLBANKER1冻存培养基,将上皮细胞冻存3个月后复苏,细胞存活率大于80%,将其在温敏性培养皿培养后成功得到了细胞片。Oliva等[32]用不同冻存剂将COMECs玻璃化冷冻并保存,结果表明乙二醇和DMSO组成的溶剂会导致p63表达的缺失,而COMECs在液氮中冻存后形态及表型保持良好,证明其可以在液氮中长期保存。

2 口腔黏膜上皮移植的临床应用

临床上双侧LSCD远比单侧疾病常见,而应用非角膜缘组织在双侧LSCD病例中进行自体移植,可避免与同种异体移植相关的问题。在所有治疗性非角膜缘细胞类型中,COMET已在世界范围内得到了广泛应用。

2.1 口腔黏膜上皮移植的优势

临床上,LSCD治疗成功的标准包括:稳定透明角膜上皮的重建、角膜结膜化/血管化的消退以及持续性上皮缺损的修复。在一项比较研究中,接受同种异体培养角膜缘上皮移植的患眼中约一半视觉明显改善,而接受COMET的患眼中则达68%[33]。Dobrowolski等[34]对17例无虹膜患眼行COMET并随访12～18个月,术后76.4%患眼有规则的透明上皮,88.2%的病例视力有所提高。Prabhasawat等[35]对COMET术后20例患者20眼平均随访31.9个月,75%取得了临床成功,患者不适、结膜炎症和纤维血管组织形成明显减少,70%患者术后视力提高。对2004-2019年已发表病例的综述显示,70.8%的LSCD患眼在COMET术后可获得稳定的眼表[30]。2021年6月,全球首个用于LSCD治疗的COMET产品Ocural®在日本上市,已成功应用于临床眼表移植且术后并发症少[36]。由此可见,COMET是LSCD患者有效的治疗方式。

针对伴有明显角膜混浊和/或内皮功能障碍的严重LSCD,通常在COMET手术恢复眼表稳定后行穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty,PKP),以获得更佳的角膜透明度。Baradaran-Rafii等[37]评估了化学烧伤所致的双侧LSCD患者行两步法手术的中期疗效,术后平均随访28.2个月,14只患眼中有13只术后眼表稳定,无上皮缺损,无明显新生血管形成,移植物总存活率和无排斥存活率分别为92.9%和69.2%。在另一项研究中,对1例具有10年化学烧伤病史、双眼Roper-Hall 4级的患者行COMET及PKP系列手术,成功恢复了一侧眼的视功能,证明了手术方式对晚期LSCD患者视觉功能恢复的有效性[38]。

2.2 口腔黏膜上皮移植的不足

COMET治疗LSCD的有效性和安全性已被基础实验和临床试验证明,然而仍有多种因素会导致移植的失败。首先,COMET术后新生血管生成及持续性角膜上皮缺损(persistent corneal epithelial defects,PED)发生率较高。多项研究表明口腔黏膜细胞比角膜缘细胞具有更大的血管生成潜能,导致移植后对新生血管的抑制能力相对较弱[39]。术后PED的发生率与术前PED密切相关。有研究提出术后PED与COMECs抗氧化能力弱及黏附相关分子表达低有关[40]。COMET术后常见的并发症为睑球粘连,初诊为瘢痕性眼表疾病的患者行再次修复手术的概率最高,而对于术前即患睑球粘连或眼睑异常的患者,角膜移植的风险较高[41-42]。此外,结膜微生物菌群具有导致术后感染的可能,受损眼表缺乏正常结膜组织,加上免疫机制的减弱,可导致损伤的加剧[43]。而尽管口腔黏膜上皮与角膜缘上皮表达相似的基因标志物,两者的形态、功能和微环境仍存在差异。在当前的临床研究中,COMET后上皮细胞仍维持口唇黏膜的表型,可能会导致上皮增厚,视觉效果不佳[44]。

总体来说,COMET能在严重LSCD患者中实现眼表上皮的持续重建,但需注意术后并发症的防护。术前行结膜菌群培养及抗感染治疗,术后进行PED和新生血管管理,术前术后及时纠正眼睑异常,可能会进一步提高此类手术的临床疗效。

3 展望

COMET已成为临床领域治疗LSCD的重要方法,但不同研究中培养方式的差异性以及临床应用中可能出现的移植并发症,都对COMECs培养的进一步优化提出了要求。建立上皮细胞片培养、储存、质量评估和标本运输的标准化体系,培养符合GMP标准的口腔黏膜上皮细胞片,探究良好的体内诱导口腔黏膜上皮转分化方案,将有利于未来COMET临床疗效的提升。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突