从铁死亡探讨独活寄生汤防治骨关节炎的机制*

许丽梅,董丹宇,薛维婳,罗芳芳,高松,李西海,林木南

1.中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院,福建 福州 350002; 2.福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见且复杂的骨关节疾病,其特征是关节软骨退化,导致严重的关节疼痛、关节畸形甚至残疾[1]。据粗略统计,全球OA患者约有5亿人。由于人口老龄化、预期寿命延长、肥胖人群增多等原因,OA已成为世界第四大致残疾病[2]。据统计,在不同的高收入国家,OA医疗费用占GDP的1.0%～2.5%。OA的病变涉及整个关节,包括软骨、软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉的结构变化等[3]。其发病与年龄、性别、肥胖、负重、运动、糖尿病、遗传因素等相关,且这些因素之间可相互作用[4]。

OA属于中医“痹证、痿证”范畴,以本痿标痹为核心病机,以“筋骨失养”所致的软骨退变等为主要病理改变[5-6]。OA的治疗应重在调理肝肾,使筋骨得养,同时佐以祛风寒湿药,蠲痹止痛。独活寄生汤(孙思邈《备急千金要方》)是治疗OA的经典名方,具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功,广泛应用于OA的临床治疗,且疗效确切。课题组前期研究表明独活寄生汤具有抗炎[7-8]、抗凋亡[9]等作用,其机制涉及炎症反应、氧化应激、凋亡、自噬等,以此发挥防治OA的作用。铁死亡是新发现的一种细胞死亡方式,被证实与OA密切相关[10],故本文将简述铁死亡的主要机制,论述铁死亡与炎症反应、氧化应激、自噬等之间的关联,探讨独活寄生汤通过铁死亡相关通路防治OA的相关机制,旨在阐明从铁死亡论治独活寄生汤防治OA的科学依据,为独活寄生汤及中医药的研究提供新的方向。

1 铁死亡的关键过程

铁死亡的特征是膜脂质过氧化产物的积累和质膜多不饱和脂肪酸的消耗。在遗传和形态学水平上,铁死亡明显不同于坏死、凋亡等细胞死亡模式,其在形态学上表现为线粒体嵴减少和线粒体外膜破裂,导致线粒体功能障碍等[11-12]。铁死亡的发生机制主要与铁代谢、脂质过氧化和氨基酸代谢等有关,其中铁代谢、脂质过氧化被认为是铁死亡的中心介质[13]。

胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白系统(cystine/glutamate antiporter system X-,system Xc-)是一种质膜胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白,该转运蛋白通常存在于磷脂双层中,system Xc-还是细胞抗氧化系统的一个组成部分[14]。胱氨酸和谷氨酸可以通过system Xc-在细胞内外11进行交换,胱氨酸在细胞内降解为半胱氨酸,该物质与谷胱甘肽(glutathione,GSH)的产生密切相关,还是维持谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)功能的关键因子,GSH在GPX4存在下能够抑制活性氧[15](reactive oxygen species,ROS)。若抑制system Xc-功能减少胱氨酸吸收,影响GSH的产生,会导致GPX4活性下调并大大削弱细胞的抗氧化能力,最终导致氧化损伤和铁死亡[16]。

铁是人体的必需物质,体内铁的代谢异常会影响机体正常生理过程。在血液中,铁多以Fe2+的形式存在,主要来源于红细胞降解或肠道吸收[17]。铁稳态依靠转运蛋白和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)分别将Fe2+、Fe3+泵至细胞外空间和细胞质来维持。Fe3+通过TFR-转铁蛋白复合物转移到内体,被还原为Fe2+,并释放到不稳定的铁池中,铁转运蛋白(ferroportin,FPN)则将多余的Fe2+氧化为Fe3+[18]。正是这种严格的铁的体内回收利用,调节细胞内的铁稳态,一旦铁在体内的回收利用循环失衡,导致游离铁大量聚积,催化芬顿反应,氧化细胞膜中的脂质,通过脂氧化酶(lipoxygenase,LOX)催化脂质过氧化则导致铁死亡发生[19]。

细胞内除了铁的积累外,脂质代谢紊乱也是铁死亡发生的基础[20]。磷脂是细胞膜中流动的主要成分,其中多不饱和脂肪酸易受脂质过氧化的影响,并且是铁死亡的必需物质,但必须经过酯化、氧化才可作为铁死亡关键物质[21]。相关研究还表明,含有花生四烯酸(arachidonic acid,AA)或其延伸产物肾上腺素的磷脂酰乙醇胺,是细胞发生氧化并走向铁死亡的关键磷脂[16]。当铁依赖性ROS过度升高时,会发生多余的多不饱和脂肪酸过氧化,导致细胞膜功能障碍并推动细胞走向铁依赖性细胞死亡。

2 OA中铁死亡与炎症反应、氧化应激、自噬等的关系

近年来,研究证实铁死亡是OA进程中的重要机制。临床观察表明,OA患者的血清或血浆、滑液、滑膜、软骨中均有铁沉积和铁相关蛋白的表达改变,并有脂质过氧化程度增加(如MDA等),抗氧化系统激活下降(如GSH和GPX);在OA动物模型中观察到铁沉积和脂质过氧化,在铁过载动物模型中则存在OA病理改变,而这些改变均可以被铁螯合剂或抗氧化剂逆转。其机制可能在于铁死亡通过与脂质过氧化、炎症反应和氧化应激等相互作用,造成软骨退变、滑膜炎和细胞外基质降解,加速OA的病情进展。铁死亡是造成软骨细胞死亡的重要原因,且主要与ROS聚集、细胞结构破坏有关,并在滑膜增生及细胞外基质降解中均发挥作用。所有证据表明,铁死亡与OA密切相关。

2.1 OA铁死亡与炎症反应炎症是机体受到致炎因子的刺激后出现以防御为主的病理过程。AA是细胞膜脂的主要成分,在细胞应激时被磷脂释放,代谢主要途径:LOX和环氧化酶(cyclooxygenase,COX)途径,使AA被进一步代谢为炎症介质,COX和LOX活性受细胞脂质氢过氧化物稳态水平的直接控制[22]。铁死亡发生时会释放大量氧化的脂质介质,促进COX和LOX活性,介导炎症反应[23]。GPX4可以降低细胞内氧化还原状态直接抑制这些酶的活化。研究证实,GPX4能通过调控核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路,降低LOX、ROS水平,抑制炎症[24]。一旦GPX4缺乏,即可诱发炎症反应,表明炎症与铁死亡有密切联系。一些炎性细胞因子不仅在铁死亡和炎症之间的相互作用中产生影响,还可以诱导软骨细胞铁死亡。

炎症是OA进展过程中的关键环节[25]。炎症因子的表达与软骨损伤呈正相关,介导软骨细胞外基质分解代谢的炎症因子有许多,白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是其中一个关键因子[26]。研究表明分别使用IL-1β模拟细胞软骨炎症、枸橼酸铁铵模拟铁过载,结果证明二者均能成功诱导软骨细胞铁死亡,导致软骨细胞脂质中ROS积累和铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL4、SLA7A11表达的变化,使用相关抑制剂Ferrostatin-1后则逆转了上述蛋白的表达,同时改善软骨基质相关因子的表达[27]。另一项研究结果同样使用IL-1β干预小鼠软骨细胞从而模拟炎症反应,与经典的铁死亡诱导剂Erastin诱导的软骨细胞铁死亡进行对比,结果表明,IL-1β同样可以增加ROS和脂质过氧化终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平,并改变了软骨细胞中铁死亡相关蛋白的表达。以上均表明了炎症因子能够介导软骨细胞铁死亡[28]。

2.2 OA铁死亡与氧化应激当细胞内的ROS累积到一定程度,超出抗氧化系统的处理范畴,过量的ROS堆积导致氧化损伤,称为氧化应激。研究表明GSH的下降是氧化应激产生的一个重要原因,而在铁死亡中亦有GSH的下降。铁作为人体必须的微量元素之一,由于其易被还原为Fe2+和氧化成Fe3+,经常参与底物之间的电子转移,而电子转移是机体代谢产生ROS必不可少的环节[29]。研究发现Fe2+可以诱导产生氧化应激[30],而氧化应激又能影响铁稳态的相关基因。故铁离子在氧化应激和铁死亡中均扮演关键角色。

红系衍生的核因子2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2),是多种抗氧化酶的主要调节剂,不仅调控细胞氧化应激的状态,还是调节细胞氧化还原稳态的关键[31],Nrf2被激活后,会从细胞质移动到细胞核,然后通过结合抗氧化反应元件激活抗氧化酶基因。多个抑制铁死亡的关键因子受Nrf2的调控,其下游多个靶基因还参与细胞中的抗氧化还原失衡。例如铁蛋白的轻链和重链(FTL/FTH1)是关键的铁储存蛋白,以及负责铁转出的运铁蛋白均受Nrf2控制[32-33]。另外,许多与GSH合成和代谢相关的整合酶均在Nrf2的调控下,包括谷胱甘肽合成酶和system Xc-(SLC7A11)等[34]。而GPX4不仅是抑制铁死亡的关键因子,也是Nrf2转录靶标[35]。Nrf2是抑制脂质过氧化和铁死亡的关键物质,也是细胞通过控制氧化应激反应抑制铁死亡的途径之一。

在一项关于软骨细胞铁死亡的研究中发现,经IL-1β处理软骨细胞后Nrf2及其下游效应因子的总蛋白水平的表达明显提高,使用铁死亡抑制剂后,Nrf2等的表达及其核转位现象进一步增强,表明铁死亡限制了Nrf2抗氧化系统的激活。此外,进一步研究发现,敲除Nrf2会导致软骨细胞GPX4水平降低,且Nrf2抗氧化系统和铁死亡在炎症和铁过载条件下相互调节[27]。

2.3 OA铁死亡与自噬自噬作为细胞内的降解系统,维持细胞内能量代谢的稳定状态。适度自噬对于细胞具有保护作用,过度自噬会促进铁死亡的发生,甚至凋亡[36]。在细胞内,自噬同样可以通过铁代谢来介导铁死亡的发生。铁蛋白的选择性自噬,称为铁自噬,属于自噬的一种,当铁蛋白转换减少使铁显著减少,打破铁稳态,即可诱发铁死亡,而核受体辅活化子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)作为细胞自噬中溶酶体的重要转运物质,将铁蛋白递送到自噬体以进行溶酶体降解,促进自噬的降解作用,并释放游离铁,从而促进铁死亡[37]。铁代谢和铁蛋白吞噬的调节是铁死亡的额外潜在控制点。

铁死亡又与自噬、细胞凋亡相互串扰。近年来,通过自噬抑制软骨细胞凋亡引起了广泛关注[38]。最新研究表明,OA软骨中的自噬水平降低,自噬可以保护软骨细胞免于降解[39]。酵母Atg6同系物1(Beclin-1)是自噬关键分子,在保护软骨细胞和改善OA中发挥重要作用[40-41]。Beclin-1与凋亡关键因子Bcl-2在细胞内相互结合的相对数量在一定程度上决定了细胞的自噬水平,当二者结合时,会抑制细胞自噬,反之则会激活细胞自噬。Beclin-1还可以作用于system Xc-的SLC7A11蛋白,形成Beclin1-SLC7A11复合物,Beclin1-SLC7A11复合物可抑制SLC7A11活性,诱发细胞铁死亡,即Beclin1会阻断system Xc-促进铁死亡[42]。因此,自噬与OA铁死亡发生密切相关。

3 独活寄生汤抑制软骨细胞铁死亡的理论依据

3.1 独活寄生汤治疗OA的组方依据独活寄生汤,由独活、细辛、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、桂枝、川芎、当归、芍药、干地黄、人参、茯苓、甘草共15味药物所组成。方中独活为君,长于祛风化湿,蠲痹止痛;防风、秦艽、细辛、肉桂,四药皆为臣药,防风、秦艽祛风除湿止痛;细辛发散少阴之邪;肉桂温里以散阴寒,通利血脉;佐以杜仲、桑寄生、芍药、牛膝以治本,滋补肝肾以强健筋骨;川芎、当归、干地黄和营养血;人参、茯苓、甘草益气扶正健脾;甘草调和诸药,兼为使药。该方切合OA病因病机特点,具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功,标本兼顾,是临床治疗OA的常用经典名方之一。

3.2 独活寄生汤通过铁死亡防治OA的依据现代网络药理学研究发现,独活寄生汤治疗膝骨关节炎以黄酮类、香豆素类、甾体类及多糖类等有效化学成分为基础,通过调控相关炎性因子、干预氧化应激、抑制细胞外基质降解、影响细胞增殖和凋亡等不同途径发挥作用,体现了中药复方多成分、多靶点、多途径的特点[43]。既往关于独活寄生汤的研究已证实,其可通过抑制炎症反应、氧化应激、自噬、凋亡等相关通路,发挥促进关节软骨修复、延缓软骨退变的作用。

以IL-1β等为代表的炎症介质通过介导多个炎症信号通路,参与软骨退变,在OA发生发展过程中常作为软骨细胞的炎症、凋亡诱导剂。最新研究表明,IL-1β亦能诱导OA软骨细胞、滑膜细胞铁死亡[27-28]。GPX4作为铁死亡调节的关键参与者,不仅能够负调控铁死亡,还可以抑制炎症反应,如AA的氧化及NF-κB通路的激活[44]。GPX4通过MAPK/NF-κB信号通路调节铁死亡及细胞外基质降解,从而缓解OA的进展[45]。GPX4在OA与铁死亡中发挥重要作用。课题组前期研究发现,独活寄生汤通过调控炎性因子IL-1β、TNF-α进而抑制炎性反应,延缓关节软骨退变[46];并作用于TLR4/NF-κB炎症通路,抑制关键信号转导因子NF-κB的表达发挥重要的抗炎作用[7]。

ROS在OA软骨中含量很高,是慢性炎症的主要原因之一[47]。研究证实,独活寄生汤可以调控氧化应激,减轻氧自由基对软骨细胞的破坏,加速氧自由基清除,抑制关节软骨的退变,延缓OA的进展。临床研究证明口服独活寄生汤可显著减低OA患者关节液中NO、MDA的含量。MDA可反映体内氧自由基对软骨细胞的破坏程度和氧化应激水平变化[48]。自噬中的关键因子Beclin-1与自噬的发生呈正相关。有学者采用Videman造模法制作兔骨关节炎模型,结果显示模型组软骨中自噬水平升高,软骨组织Beclin-1、Bcl-2等表达升高,予以加味独活寄生合剂干预后,Beclin-1、Bcl-2进一步升高,提示加味独活寄生合剂可促进自噬,通过提高自噬水平从而改善关节软骨[49]。

4 结语

随着研究的深入及科技的发展,近年来关于OA病理机制的探索不断深入、拓宽,软骨细胞、滑膜细胞等细胞死亡方式及相关机制的研究也不断深化,但仍未能完全阐明OA的病理机制。铁死亡的出现则为OA机制和治疗研究提供了新的切入点,并且由于铁死亡与炎症反应、氧化应激、自噬、凋亡等有着千丝万缕的联系,提示从铁死亡的角度抑制炎症、氧化应激等,也为OA的治疗提供新的靶点。独活寄生汤治疗OA由来已久,现代研究表明,独活寄生汤可以通过抑制炎症反应、氧化应激,调控自噬、凋亡等机制,改善软骨退变,延缓OA进程,这也是独活寄生汤多成分、多靶点靶向治疗OA的药理机制,故探讨独活寄生汤抑制OA铁死亡有坚实的理论基础和科学价值。既往关于独活寄生汤的研究大多相对孤立,无法体现中医治疗的整体观念,而铁死亡的出现则将各种病理机制联系到一起,不仅有利于OA机制的研究,也为独活寄生汤防治OA的研究提供新的思路,更能体现中医整体观念,及中医药多靶点、多通路的特性。但目前关于铁死亡及其在OA中作用的研究尚不够全面,不同机制间的串扰更是错综复杂,需要进一步完善和挖掘。