孕酮对鲫鱼胚胎发育和内分泌干扰效应

王晨， 满晓婷， 王颖， 张云紫， 周新雨， 万汝燕， 夏晓华

（河南师范大学生命科学学院，河南新乡453007）

内分泌干扰物是一类激素类环境污染物，类固醇激素被认为是内分泌干扰物中最活跃的药物类别之一，极少量残留即可影响水生脊椎动物的繁殖和发育。作为一类重要的类固醇激素，孕激素具有调节内分泌与生殖周期的功能。孕酮（P4）是一种典型的孕激素，它被广泛用于人类激素替代疗法、避孕药的制作和其他医疗应用（Lianget al.，2015），还被广泛应用于畜牧养殖业，以提高动物产量和相关的经济效益。P4会以粪便和尿液的形式进入污水处理厂，由于不能被完全去除，其在水体中的残留往往超过正常范围，给水生生物带来了潜在的严重风险。污水处理厂废水中的P4浓度为4.5～24.8 ng·L-1（Yarahmadiet al.，2018），猪场和奶牛场废水中的P4浓度高达3 470～11 900 ng·L-1（Liuet al.，2012）。

环境中较低的P4残留即可影响生物体内源激素的合成、分泌和代谢，干扰机体内环境的稳态平衡，进而影响生物体正常的生长、发育和繁殖过程。在3.5～306 ng·L-1的P4中暴露14 d，雌性斑马鱼Danio rerio的卵母细胞加速成熟且卵巢受到生理性损伤（Zucchiet al.，2013）。Wang等（2020）研究发现，在50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4处理下，雄性鲫鱼Carassius auratus的精巢中出现卵原细胞，高浓度P4暴露组有更多的雌鱼产生，使鲫鱼性别比偏向雌性。鱼类的生殖活动受下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary gonadal，HPG）轴的调节，Hou等（2018）发现斑马鱼在幼鱼阶段接触炔诺酮可能会影响性腺分化和性别比例，并归因于HPG轴基因表达的改变。Zhao和Fent（2016）的研究表明，昼夜节律可以调节HPG轴相关活动及各种重要的生物过程。因此，HPG轴和昼夜节律相关基因的表达改变可能干扰鱼类的性腺发育，进而影响其繁殖。

鱼类是低等的水生生物，其性腺发育和性别决定方式易受外界环境内分泌干扰物的影响。杨倩等（2021）研究发现，双酚F能导致下丘脑-垂体-甲状腺轴、HPG轴和下丘脑-垂体-肾上腺轴上一系列基因的表达水平发生改变，进而影响斑马鱼的内分泌功能。Zeilinger等（2009）发现在0.8 ng·L-1环境浓度水平的左炔诺孕酮影响下，雌鱼的卵细胞结构及卵巢发育发生显著改变。因胚胎相较于成鱼和幼鱼对污染物更敏感（Nagel，2002），本文以鲫鱼胚胎为实验对象，讨论P4对鲫鱼胚胎发育以及其对昼夜节律和HPG轴相关基因表达的影响，从而揭示P4对鱼类早期胚胎的生态毒理学效应。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

孕酮标准品购自上海成捷化学有限公司，将其溶解在100%乙醇中用作储备溶液（1 mg·mL-1），然后用脱氯自来水稀释以获得实验浓度。4 ℃避光保存。

1.2 实验动物

鲫鱼购自河南师范大学水产学院水产养殖中心，置于200 L水箱中用曝气自来水驯养1周。随机挑选健康性成熟的亲鱼，用干法人工授精获取受精卵。将正常发育的囊胚期胚胎随机分配到直径为180 mm的培养皿，每个培养皿中均匀分布300～500个胚胎，暴露处理144 h，至所有胚胎全部孵出。

1.3 P4毒性暴露实验设计

一部分培养皿暴露于浓度为10 ng·L-1、100 ng·L-1、1 000 ng·L-1、10 000 ng·L-1的 P4、0.001%乙醇和曝气自来水（空白对照组）中处理144 h，倒置显微镜下观察胚胎的发育状况，记录死亡数、孵出数和畸形数，并选择异常个体进行拍照；另一部分培养皿暴露于浓度为5 ng·L-1、50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4和曝气自来水（空白对照组）中处理144 h（乙醇溶剂终浓度低于1‰，且空白对照组和乙醇溶剂组结果不存在显著差异，因此仅保留空白对照组），同时在暴露24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和 144 h时从每组随机挑选20～30个胚胎，保存于液氮中。以上所有实验均设置3个重复。每隔24 h更换暴露溶液，在整个实验过程中，所有胚胎均维持在（26±1） ℃的温度下，并进行光照∶黑暗（14 h∶10 h）循环。

1.4 基因转录水平分析

使用 Total RNA extraction reagent（TaKaRa）对鲫鱼胚胎进行总RNA提取，琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测RNA的完整性和纯度，使用Prime Script逆转录酶（TaKaRa）进行cDNA合成。利用Primer Premier 5和Oligo 7对本实验中所要研究的基因进行特异性引物设计，在LightCycler®96实时荧光定量PCR仪中进行qRT-PCR。25 μL反应体系包括：12.5 μL 2×TransStart®Top/Tip Green qPCR SuperMix，上、下游引物（表 1）各 0.5 μL，1 μL cDNA 和10.5 μL ddH2O，反应程序为：94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s（45×）；94 ℃ 10 s，65 ℃60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。选取了昼夜节律相关的6 个基因Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1，HPG轴相关基因Gnrh2、Gnrh3、Fshβ、Lhβ和类固醇生成相关基因Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β，检测其转录表达水平。选40S rRNA为管家基因，实验重复3次。使用LightCycler®96 SW1.1分析数据，所得数据采用 2-ΔΔCt计算。

1.5 数据分析

所有数据均以xˉ±SD表示，并用SPSS 16.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。统计学显著性差异水平设置为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 P4暴露对鲫鱼胚胎形态发育的影响

胚胎毒性实验显示，P4对鲫鱼早期胚胎形态发育没有明显的致死、致畸效应（图1）。在整个暴露过程中，空白对照组、0.001%乙醇对照组和4个浓度P4暴露组中的鲫鱼胚胎在144 h后全部孵出，存活率分别为82.61%、78.41%、81.08%、75.63%、80.33%和82.80%，没有显著差异；畸形率分别为4.10%、3.70%、5.20%、3.90%、4.67%和5.07%。

图1 P4对鲫鱼早期胚胎形态发育的影响Fig. 1 Effects of P4 on morphological development in early embryos of Carassius auratus

2.2 P4对鲫鱼早期胚胎发育过程中昼夜节律相关基因表达的影响

与空白对照组相比，5 ng·L-1或更高浓度的P4暴露组中，从24 h到144 h，Clock1和Arntl1基因的表达水平整体呈先升高后降低再升高的趋势（图2：A、B）；Cry1基因的表达水平在48 h和96 h上调（图2：C）；Cry2和Nr1d1基因的表达水平在24 h、120 h和144 h显著上调，而在72 h和96 h被抑制（图2：D、E）；Per2基因的表达水平在24～96 h被抑制，但120 h后又上调（图2：F）。

图2 P4对鲫鱼胚胎发育过程中昼夜节律相关基因表达水平的影响Fig. 2 Effects of P4 on the expression levels of circadian rhythm related genes during the embryonic development of Carassius auratus

2.3 P4对鲫鱼早期胚胎发育过程中HPG轴相关基因表达的影响

与空白对照组相比，P4暴露组中Gnrh2基因的表达水平在96 h显著降低；而5 ng·L-1P4暴露24 h、48 h和120 h， 50 ng·L-1P4暴露24 h、72 h、120 h和144 h以及100 ng·L-1P4暴露144 h后，Gnrh2基因的表达水平均显著升高（图3：A）。P4暴露组中，Gnrh3基因的表达水平在96 h受到了显著诱导，而在120 h和144 h被显著抑制（图3：B）。P4暴露组在 72 h 以及 100 ng·L-1P4处理144 h时，Fshβ基因的表达水平显著提高，而在其他大多数时间点被显著抑制（图3：C）。此外，与空白对照组相比，5 ng·L-1P4暴露处理24 h、120 h，50 ng·L-1P4暴露处理120 h以及100 ng·L-1P4暴露处理144 h后，Lhβ基因的表达水平显著上调（图3：D）。

图3 P4对鲫鱼胚胎发育过程中下丘脑和垂体激素相关基因表达水平的影响Fig. 3 Effects of P4 on the expression levels of hypothalamus and pituitary hormone-related genes during the embryonic development of Carassius auratus

与空白对照组相比，5 ng·L-1或更高浓度的P4处理72 h以及100 ng·L-1P4处理120 h显著抑制Cyp11a基因的表达；而在24 h、48 h和96 h，Cyp11a基因的表达水平显著提高（图4：A）。在24 h和144 h，不同浓度P4暴露显著提高Cyp19a基因的表达；而在72 h则被显著抑制（图4：B）。Hsd3β基因经50 ng·L-1和100 ng·L-1P4暴露处理24 h、100 ng·L-1P4暴露48 h以及5 ng·L-1P4暴露144 h，表达水平显著提高；而在72～120 h则显著降低（图4：C）。不同浓度P4暴露24 h和96 h后，Hsd20β基因的表达水平显著降低；而在72 h，Hsd20β基因的表达水平显著提高（图4：D）。

图4 P4对鲫鱼胚胎发育过程中与类固醇激素相关基因表达水平的影响Fig. 4 Effects of P4 on the expression levels of steroid hormone related genes during the embryonic development of Carassius auratus

3 讨论

胚胎毒性实验表明，P4浓度梯度对鲫鱼早期胚胎形态发育没有明显的急性毒性。梁燕秋（2016）发现，暴露于10～10 000 ng·L-1P4的斑马鱼胚胎未出现死亡、畸形的情况，与本研究结果一致。胚胎是鱼类发育最敏感、最脆弱、最关键的阶段，胚胎的正常发育是鱼体生长和繁殖的基本保障，因此，本文进一步研究了较低浓度P4对鲫鱼胚胎的内分泌干扰效应。

昼夜节律是生物体为了适应地球自转引起的以24 h为周期的行为、代谢、免疫等方面节律性变化，它由多个正、负调节因子组成的自我维持的反馈回路组成。Clocks、Arntls、Pers、Crys、Nr1ds构成了昼夜节律调控网络的核心。转录因子Clocks和Arntls是这些反馈回路的正向组件，可以激活核心昼夜节律基因——周期（Pers）和隐花色素（Crys）的转录，而Per和Cry又可以与Clock/Arntl1异二聚体相互作用，抑制异二聚体的活性。此外，Clocks/Arntls异二聚体还激活核受体基因Nr1ds的转录（Albrecht & Eichele，2003）。Nr1d1的表达可抑制Arntl1、Pers和Crys转录，从而调节昼夜节律。Zhao等（2015）研究发现，孕激素能改变斑马鱼中昼夜节律及其下游信号通路的基因表达水平。Xia等（2019）发现，孕酮能影响黄河鲤Cyprinus carpiovar.幼鱼中昼夜节律相关基因表达，进而导致内分泌系统的紊乱。本研究中P4暴露影响了昼夜节律信号通路相关基因（Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1）的表达，这与Zhao和Fent（2016）在斑马鱼中的研究结果类似。

昼夜节律可以驱动各种关键细胞和生理过程的日常振荡，如细胞周期及其调节、激素分泌、甚至繁殖等（Bedrosianet al.，2016；Zhaoet al.，2018；Zhenget al.，2018），且Zhao和Fent（2016）研究发现昼夜节律能够调节HPG轴的活动。HPG轴参与调节一系列生殖活动，促进和控制生殖细胞的起源、性别分化、性腺的发育和成熟。促性腺激素释放激素（GnRH）在HPG轴中起关键作用。在HPG轴的cAMP级联反应中，GnRH与垂体前叶促性腺激素细胞表面的跨膜受体结合，触发级联反应来调控Lhβ和Fshβ表达（Guoet al.，2003；Pawson ＆ Mcneilly，2005）。黄体生成素（LH）和卵泡生成素（FSH）控制性腺中的类固醇生成和配子发生，因此GnRH介导中枢神经系统对生殖的控制。这个过程中任何一个基因表达量的改变都可能会导致整个HPG轴的紊乱，进而影响机体的正常生长发育。本研究发现，P4处理后，Gnrh2、Gnrh3的表达水平与Fshβ、Lhβ的相一致。推测Gnrh2和Gnrh3的显著上调可能增强了Lhβ和Fshβ的表达，从而提高FSH和LH的激素水平，并进一步调节类固醇生成基因（Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β）的表达。

Cyp11a具有侧链裂解活性，能催化胆固醇转化为孕烯醇酮（Guoet al.，2003），在Hsd3β的催化作用下，孕烯醇酮或脱氢表雄酮能生成有活性的孕酮和雄烯二酮（Kruschet al.，1979）。Cyp19a在体内可催化雄烯二酮向雌二醇转化，因而又称雌激素合成酶。Walsh等（2000）研究发现LH主要通过激活Hsd20β和促进17α，20β-二羟化酮受体的转运来促进精子和卵子的发育。本研究发现，3个不同浓度P4组处理72 h后，Fshβ的表达水平显著上调；Cyp11a在5 ng·L-1P4处理96 h和120 h以及50 ng·L-1P4 处理 120 h 显著上调；5 ng·L-1P4暴露144 h后，Cyp19a和Hsd3β的表达水平上调。这表明激活的FSH促进了Cyp11a、Hsd3β和Cyp19a的表达。Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β和Hsd20β是控制类固醇生成的关键基因，这些基因的表达改变可降低或提高类固醇激素的合成效率。实验室前期对暴露结束后相同P4浓度处理条件下生长至6个月的鲫鱼的性别比进行了统计分析，与对照组相比，高浓度P4暴露组诱导更多雌鱼产生。性腺组织学分析发现，在暴露于 50 ng·L-1和100 ng·L-1的鲫鱼精巢中观察到了卵母细胞的存在（Wanget al.，2020）。这些结果说明P4可能通过干扰类固醇合成途径来影响鲫鱼的胚胎发育，进一步影响鲫鱼幼鱼和成鱼的性腺发育和性别比例。

4 结论

在胚胎发育阶段，P4对鲫鱼胚胎形态发育无急性毒性，环境相关浓度的P4可导致昼夜节律和HPG轴相关基因表达紊乱，从而导致细胞和生理代谢的紊乱，进而影响鲫鱼幼鱼的性腺分化和性比。本实验阐明了孕激素物质对水生生物的生态毒理学效应以及所引起的一系列风险，为准确评估P4对水生生物的生态风险提供参考价值。