高分辨质谱法快速筛查和定量分析改善胃肠道功能类保健食品中的22种非法添加化合物

袁阳蕾，袁利杰，郭立净，石璐

（河南省食品检验研究院，国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术），河南省特殊食品工程技术研究中心，河南郑州 450003）

随着生活节奏的加快，外卖和快餐食品成为很多上班族的主要饮食来源，随之而来的是胃肠道消化方面的疾病越来越多，改善胃肠道功能类保健食品[1]备受欢迎。其存在的安全问题不容忽视，尤其是保健食品中非法添加化学药物的事件不断被报道[2-5]。消费者购买服用非法添加药物的保健食品，会误认为产品“疗效好”、且“安全可靠，对身体无害处”，但是长期服用会对人的身体健康产生不良影响。

常见的改善胃肠道功能类化合物主要有多巴胺受体阻断药、H2受体阻断药、缓泻类药物、促胃液素受体阻断药、胃质子泵抑制药、5-HT4受体激动药[6]。这些治疗胃肠道类药物长期大量服用可能会产生腹痛、恶心、呕吐等不良反应[7-11]，严重时会危及生命安全。

目前已报道的非法添加药物的检测手段主要有光谱法[12-15]、色谱法[16-18]、色谱质谱联用法[7-11,19]、离子迁移谱[20,21]、快检试剂盒[22]等。四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法具有高分辨率和高质量精度的优点，质量范围宽，动态范围广[23]，突出了高效液相色谱的有效分离能力，同时又弥补了低分辨率质谱可能出现的假阳性问题，可以在没有标准物质的情况下，根据已建立好的数据库对未知样品进行定性分析[22]，节约时间和经济成本。目前已经广泛应用于食品安全[24-33]、药物分析[23,34-37]、代谢组学[38]等相关领域。本研究以市面上常见的改善胃肠道功能类保健食品为研究对象，建立了一种超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法，可同时快速筛查和定量测定22种非法添加化合物，为监管部门打击保健食品非法添加行为提供新的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

样品来源：48批次改善胃肠道功能类保健食品（25批次片剂和23批次口服液）样品均采购于本地市场。

标准物质：奥美拉唑（批号：100367-201706）、丙谷胺（批号：100176-201104）、法莫替丁（批号：100305-201304）、甲氧氯普胺（批号：100832-201404）、拉呋替丁（批号：100861-201302）、兰索拉唑（批号：100709-201705）、雷贝拉唑钠（批号：100658-201705）、盐酸雷尼替丁（批号：100163-201607）、盐酸洛哌丁胺（批号：100300-201102）、枸橼酸莫沙必利（批号：100656-201903）、尼扎替丁（批号：100853-201502）、泮托拉唑钠（批号：100575-201505）、马来酸曲美布汀（批号：100580-201302）、硫酸天仙子胺（批号：111982-202002）、西咪替丁（批号：100158-201406）、盐酸伊托必利（批号：100939-201803）均购于中国食品药品检定研究院；比沙可啶（批号：D0015778）购于北京曼哈格生物科技有限公司；多潘立酮（批号：21040678）购于坛墨质检-标准物质中心；地芬诺酯盐酸盐（批号：S086173）、双醋酚丁（批号：S066495）、脱乙酰比沙可啶（批号：S079839）、西沙必利（批号：S039819）购于天津阿尔塔科技有限公司。其中天津阿尔塔科技有限公司4种标准物质均为液体，含量均为100 μg/mL，规格≥1 mL；其余标准物质均为固体，纯度≥94.2%。

主要试剂：甲醇、乙腈（色谱纯），Merck德国；甲酸（色谱纯），Sigma美国；超纯水（电阻率 18.2 MΩ·cm，25 ℃，超纯水机制得）。

主要仪器设备：Vanquish超高效液相色谱-Q ExactiveTMPlus组合型四极杆/轨道肼高分辨质谱联用仪（Thermo Fisher，美国）；ME203、XPE205DR电子天平（Mettler Toledo，瑞士）；3-30K高速冷冻离心机（Sigma德国）；KQ-500 TDB温控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q IQ 7000超纯水机（Millipore美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

18种固体混合标准物质储备液的配制：精密称取比沙可啶、多潘立酮、奥美拉唑、丙谷胺、法莫替丁、甲氧氯普胺、拉呋替丁、兰索拉唑、雷贝拉唑钠、盐酸雷尼替丁、盐酸洛哌丁胺、枸橼酸莫沙必利、尼扎替丁、泮托拉唑钠、马来酸曲美布汀、硫酸天仙子胺、西咪替丁、盐酸伊托必利18种标准物质适量，用甲醇溶解并稀释，制成浓度为1 000 μg/mL的混合标准物质储备液。

22种混合标准物质中间液的配制：精密移取上述18种固体混合标准物质储备液100 μL和地芬诺酯盐酸盐、双醋酚丁、脱乙酰比沙可啶、西沙必利四种液体标准物质各1.0 mL，用甲醇稀释制成浓度为10 μg/mL的混合标准物质中间液。置于-20 ℃冰箱中储存备用。

1.2.2 样品前处理

片剂样品：取20片以上的片剂样品，经制样机打碎，研磨成粉，混匀，备用；口服液样品：混匀后备用。

准确称取保健食品试样1.0 g（精确至0.01 g），置于15 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋振荡10 min，超声提取10 min，放冷至室温，8 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm有机系滤膜过滤后供上机测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1 mm ×50 mm，1.8 μm）；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流量：0.3 mL/min；流动相：φ=0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）；梯度洗脱程序：0.0~1.5 min，10% B；1.5~2.5 min，10%~95% B；2.5~6.0 min，95% B；6.0~6.5 min，95%~10% B；6.5~10.0 min，10% B。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子扫描；扫描方式：Full MS/dd-MS2（一级全扫描/数据依赖的二级扫描）；喷雾电压：3.0 kV；S-lensRF电压：60 V；毛细管温度：325 ℃；辅助气温度：350 ℃；鞘气流速：40 Arb；辅助气流速：10 Arb。Full MS（一级质谱全扫描）分辨率：70 000 FWHM，质谱扫描范围：200~500m/z，AGC target（自动增益控制）：1.0 e5，IT（最大注入时间）：50 ms；dd-MS2（数据依赖的二级质谱扫描）分辨率：17 500 FWHM，AGC target：5.0 e4，IT：50 ms，Isolation window（分离窗口）：4.0m/z，Intesity threshold（强度阈值）：1.6 e5，同位素排除：on，动态排除：10.0 s。22种化合物的NCE（步进归一化碰撞能量）统一设为30、50和70 eV。22种化合物的一级质谱信息及二级质谱信息见表1。

表1 22种化合物质谱信息Table 1 Mass parameters for the 22 kinds of compounds

1.2.5 数据处理

通过高效液相色谱分离和质谱Full MS/dd-MS2的数据采集得到22种化合物的保留时间、一级母离子和自动触发采集的二级碎片离子信息，建立数据库，进行高通量定性筛查；以一级母离子进行定量分析，用标准品的浓度和峰面积绘制标准曲线，计算样品中化合物对应的含量，从而进行方法学的考察。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

本实验分别考察了甲醇、乙腈、甲醇/水（50:50，V/V）和乙腈/水（50:50，V/V）对两种基质（片剂和口服液）的改善胃肠道功能类保健食品中非法添加化合物的提取效率（除提取溶剂外其它步骤同 1.2.2），以加标回收的结果对比不同溶剂的提取效率。结果表明甲醇/水、乙腈/水作为提取溶剂时奥美拉唑和雷贝拉唑钠的回收率明显低于甲醇或乙腈作为提取溶剂时的回收率，乙腈作为提取溶剂时法莫替丁和西咪替丁的回收率明显低于甲醇作为提取溶剂时的回收率。而甲醇作为提取溶剂时，22种化合物在片剂基质和口服液基质中的回收率分别为81.52%~109.35%和82.13%~114.24%，均能达到较好的提取效率，因此选用甲醇作为提取溶剂。

2.1.2 提取体积的确定

本实验考察了不同提取体积（5、10、20 mL）对提取效率的影响，以加标回收率比较不同提取体积的提取效率（除提取体积外其它步骤同 1.2.2）。结果表明提取体积为5 mL时，雷贝拉唑钠在片剂基质和口服液基质中回收率分别为46.53%、59.31%，原因可能为基质复杂，干扰杂质浓度较高，存在基质抑制效应。当甲醇提取体积为10 mL时，雷贝拉唑钠的回收率明显升高。其在片剂基质和口服液基质中回收率分别达到为81.91%、83.06%，其他21种化合物在片剂基质和口服液基质中的回收率分别为 81.65%~113.85%、80.31%~ 107.11%。提取体积为20 mL时，22种化合物的回收率和提取体积为10 mL时基本一致，考虑到节约试剂成本，实验选择甲醇提取体积为10 mL。

2.1.3 提取时间的确定

考虑到部分样品为片剂，为了保证样品分散均匀，实验考察了涡旋振荡和超声提取两种提取方式同时作用的提取效率，实验分别以涡旋振荡10 min与超声提取10、20、30 min，涡旋振荡10、20、30 min与超声提取10 min进行两种提取方式的优化（除提取时间外其它步骤同1.2.2）。结果表明，涡旋振荡10 min和超声提取10 min，22种化合物在片剂基质和口服液基质中的回收率分别为80.13%~118.08%、82.67%~111.02%，延长涡旋振荡或超声提取的时间，回收率变化不大，实验最终采用提取时间为涡旋振荡10 min，超声提取10 min的前处理方法。

2.2 色谱条件的优化

由于质谱扫描模式均为正离子模式，所以流动相选取0.1%甲酸水作为水相，甲醇和乙腈分别作为有机相进行考察。结果发现，甲醇作为有机相时得到的峰形更加尖锐，分离度更高，而且能在更短的时间内使22种化合物得到良好的基线分离。因此，实验选择0.1%甲酸水和甲醇作为流动相进行梯度洗脱。22种化合物混合标准溶液（200 ng/mL）的提取离子流色谱图见图1。实验采用常见的C18色谱柱，同时考察了Agilent XDB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）两个不同品牌的C18色谱柱，发现二者没有显著性差异。

图1 22种化合物混合标准溶液的提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the mixed standard solution of 22 kinds of compounds

2.3 质谱条件的优化

根据 22种化合物分子量设定质谱扫描质量范围（200m/z~500m/z），使用Full MS/dd-MS2模式，首先进行一级质谱全扫描，发现母离子后达到自动增益控制强度则自动触发二级质谱扫描，在得到精确的一级母离子质量数的同时，还可以得到二级子离子的全扫描信息。分辨率和自动增益控制设置越高，得到的质量数精度越高，但同时会降低仪器的灵敏度和扫描速度，同样的时间采集数据点数减少，定量的准确性会受到影响，经过实验，最终选择一级质谱扫描分辨率为70 000 FWHM，自动增益控制为1.0 e5，二级质谱扫描分辨率为17 500 FWHM，自动增益控制为5.0 e4，既能满足实验所需的灵敏度，也能达到与高效液相色谱分离相匹配的扫描速度，一个扫描循环的时间约为0.8 s，扫描点数也能满足筛查与定量分析要求，实验得到22种化合物的相对质量偏差均小于1.77×10-6（见表1），准确度也满足实验需要。高通量筛查时，不同化合物的性质差异使得它们在分子断裂时所需要的碰撞能量不尽相同，设置不同的归一化碰撞能量，可以有效的解决由于碰撞能量不合适带来的二级碎片离子信号低的问题，实验统一设为30、50和70 eV，在三个不同能量下叠加二级碎片离子的信息，灵敏度能够满足分析要求，对目标化合物的定性更加准确。

2.4 阴性干扰试验

取阴性样品，按照 1.2.2制备阴性样品溶液，在1.2.3和1.2.4的色谱及质谱条件下上机测定，提取离子流色谱图，22种化合物保留时间处均没有出现干扰峰，说明本方法基质干扰小，方法专属性强，考虑到操作方便，在配制标准曲线时使用纯溶剂配制。

2.5 方法学的考察

2.5.1 定量限

高分辨质谱使用目标化合物的精确质量数提取离子流，非目标物的干扰小，色谱图基线噪音很低，信噪比往往非常大，不太适用以 3倍信噪比（S/N）确定目标物检出限，10倍信噪比确定目标物定量限的方法。因此，本实验采用向空白样品中逐级降低加标浓度，按照1.2.2的前处理方式，以22种目标化合物的回收率均满足60%~120%区间内的最低浓度为定量限，22种化合物定量限均为50 µg/kg（见表2）。

2.5.2 线性范围与标准曲线

用甲醇稀释1.2.1配制的标准物质储备液，得到浓度为5、10、20、50、100、200、300、400、500 ng/mL的标准系列工作液进行上机测定，以化合物的质量浓度为横坐标，对应的一级母离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程，得到相关系数（r2），见表2。结果表明，22种化合物在5 ng/mL~500 ng/mL的浓度范围内线性关系良好，r2均＞0.995。说明本方法可以在此线性范围内准确定量各目标化合物。

表2 22种化合物的线性方程、相关系数和定量限Table 2 The linear equation, correlation coefficient and limit of quantitation of the 22 kinds of compounds

2.5.3 回收率、准确度与精密度

取片剂和口服液两种基质改善胃肠道功能类保健食品阴性样品进行加标回收试验。分别添加100 µg/kg、500 µg/kg、1 000 µg/kg三个浓度水平，按照1.2.2前处理方法制备样品加标溶液，每个添加水平平行制备6份样品，上机进行测定，得到22种化合物的峰面积，计算回收率和相对标准偏差（RSD），回收率用于评价准确度，RSD值用于评价精密度，结果见表3。结果表明，片剂基质中 22种化合物的回收率在 82.11%~116.16%之间，RSD在0.60%~8.62%之间。口服液基质中22种化合物的回收率在83.64%~117.21%之间，RSD在0.86%~9.36%之间。表明22种化合物在两种基质中的回收率高，准确度高，精密度好。

表3 22种化合物在片剂和口服液样品中的加标回收率和精密度（n=6）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSD) of the 22 kinds of compounds in tablet and liquid form (n=6)

2.5.4 基质效应和稳定性

取片剂和口服液两种基质改善胃肠道功能类的保健食品阴性样品进行加标回收试验。添加水平为1 000 µg/kg，按照1.2.2前处理方法制备样品加标溶液。将基质加标溶液和相同浓度的标准溶液（100 ng/mL）分别进样，得到峰面积，计算响应百分比，即为基质效应。结果表明2种基质中22种化合物的基质效应均在88.6%~112.5%之间，表明两种基质对22种化合物的基质影响较小。

将基质加标溶液分别在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h的时间进样，得到22种化合物的峰面积，计算回收率，考察稳定性。结果表明在24小时内，2种基质中22种化合物的添加回收率在90.2%~113.9%之间，随时间变化小，表明加标提取溶液的稳定性良好。

2.6 数据库的建立

按照1.2.3和1.2.4的实验条件，分别对22种化合物标准溶液进行质谱数据采集，得到保留时间、一级母离子的准确质量数和二级碎片离子的准确质量数，导入TraceFinder软件，建立22种化合物的定性快速筛查数据库。若样品中检测出的某种物质保留时间、一级母离子的准确质量数和二级碎片离子的准确质量数均与已建立的数据库中的化合物信息相匹配，可以初步认定样品中检出该化合物。可以进一步用该化合物的标准溶液在相同条件下得到保留时间和一级母离子的峰面积确证和定量分析，从而实现改善胃肠道功能类保健食品中 22种非法添加化合物的快速筛查和定量检测。

2.7 实际样品的测定

按照1.2.2前处理方法和1.2.3与1.2.4的仪器方法对48批次改善胃肠道功能类保健食品（25批片剂和23批口服液）进行测定，经过与建立的数据库进行比对，筛查出其中3批样品检出马来酸曲美布汀，1批样品检出多潘立酮。经定量计算，马来酸曲美布汀检出值分别为 3.02×103μg/kg、1.62×103μg/kg 和0.43×103μg/kg；多潘立酮检出值为 1.59×103μg/kg。

3 结论

本实验建立了一种超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法，可以快速筛查同时定量分析片剂和口服液两种基质的改善胃肠道功能类保健食品中非法添加化合物。依据保留时间、一级母离子精确质量数、二级碎片离子精确质量数建立数据库进行快速定性筛查，一级母离子进行定量分析。该方法操作简单快速，灵敏度高，结果准确，适用于改善胃肠道功能类保健食品中非法添加化合物的快速筛查和定量分析，为监管部门打击保健食品非法添加行为提供了新的技术支撑。