胱氨酸谷氨酸反向转运体在脑卒中的作用及活性调控的研究进展

王艺莹,郭 健 综述,李瑞青 审校

0 引 言

脑卒中是目前世界上致残率最高的一种脑血管类疾病,其是由于脑部血管栓塞堵塞导致血流不畅或是血管破裂引起出血等,引发和出现的脑血管类疾病,发病后极易造成脑神经和细胞等局部组织的损伤与凋亡[1-2]。据统计,脑卒中的患病率呈现了逐年增多的一种态势,已经成为了世界上危害人类健康的三大疾病之一,且其发病时间和趋势日益年轻化,从多方面影响着患者的工作、日常生活以及生存质量。根据WHO报道,脑卒中患者在经过有效治疗康复后,能够恢复基本生活能力,并且回归社会的概率高达60%,由此可见卒中后早期治疗尤为重要[3]。因此,全面了解脑卒中后的发生发病机制,对于疾病的诊断和治疗至关重要。

胱氨酸谷氨酸反向转运体(cystine /glutamate antiporter)又被称为xc系统、System xc-或xCT(本文统一用System xc-表达),是一种在细胞膜上的跨膜氨基酸转运体,能够1∶1等比例的转运胱氨酸和谷氨酸(glutamate,Glu)。根据研究发现,System xc-不仅与机体神经递质的信号传递、维护抗氧化还原系统的平衡等关系密切,还参与了中枢神经系统疾病、机体内肿瘤的生长等多种疾病的病理生理过程[4]。因此,有望通过全面了解System xc-相关作用机制,将其作为新的诊疗靶点出发对脑卒中等更多神经系统疾病的治疗提供新的方向。本文就System xc-的生物学结构和功能、在脑卒中后的生物学效应以及影响其活性的物质从而寻找潜在治疗靶点等作一综述。

1 System xc-的生物学结构和功能

System xc-是由溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)组成的二硫键连接异源二聚体,属于异二聚体氨基酸转运体家族(heterodimeric amino acid transporter, HAT)。SLC7A11主要负责谷氨酸与胱氨酸的转运,SLC3A2负责协助SLC7A11的胞内运输以及在胞膜上的定位,同时将SLC7A11铆钉在细胞膜上使其更好地发挥生物活性[5]。因此,其发挥主要转运生物活性的物质和显示其特异性的即是SLC7A11。System xc-的主要功能作用是可向细胞内转运胱氨酸(其是半胱氨酸的细胞外氧化形式),以交换细胞内Glu逆向转运蛋白。System xc-可转运Glu,属于一种酸性氨基酸转运蛋白体。其转运方向主要是受胞膜内外两侧Glu的浓度梯度差所驱动的,而不受Na+造成的电化学梯度浓度差的影响,因此也被称为是一种非Na+依赖性的转运体蛋白[6]。由于在大脑内总的Glu浓度约为10 mmol/L ,而脑脊液内所含的Glu浓度仅为2～9 μmol/L,细胞内外较大的Glu浓度梯度差也就此决定了System xc-的生物体转运方向[7]。SLC7A11蛋白一共由501个氨基酸组成,含有12个跨膜区,N端和C端都位于细胞内,在第2、3胞内环之间有一个明显的折返样的结构。SLC3A2由529个氨基酸组合而成,共含有8个β链,属于N-糖基化Ⅱ型膜蛋白的一种[8]。在正常的情况下,System xc-在机体内的表达会呈现出组织特异性。在啮齿类动物的研究中发现,脑组织中存在有SLC7A11的高表达,其中检测可显示出星形胶质细胞中的反向转运蛋白转运活性最高,而肺、肾、肝和心脏内几乎无SLC7A11表达[9]。在人体的研究中发现[10],人体的脑和脊髓内会含有SLC7A11的高表达,但是其在淋巴、外周白细胞、胸腺、脾内则几乎无表达。但是人类肿瘤的许多种类中如乳腺癌、淋巴瘤等均发现有SLC7A11表达。

2 System xc-与脑卒中的关系

2.1 半胱氨酸转运障碍影响氧化应激系统System xc-在脑卒中等中枢神经系统疾病中的作用与Glu浓度和半胱氨酸转运有关。当脑卒中发生时,由于大脑中的相关转运体和合成酶作用失活,会使得兴奋性的神经递质Glu和抑制性的神经递质γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)的释放、转运和重摄取异常,Glu释放增多,GABA释放减少,二者失衡[11]。胞外Glu浓度升高使得Glu与胱氨酸平衡被打破,会抑制SLC7A11的转运活性使其停止向外继续转运Glu,同时向内交换的胱氨酸也逐渐减少直至停止。正常情况下,胞外胱氨酸会通过被SLC7A11摄取而进入细胞,然后通过还原反应可以迅速的转化为半胱氨酸(Cysteine,Cys)。γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)参与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的合成,是合成GSH的一种关键限速酶[12],Cys在γ- GCS的催化作用下会与Glu进行结合,从而合成γ-谷氨酸半胱氨酸。之后,在谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)介导过程中,甘氨酸分子酶会加入进行反应,最终会产生GSH[13]。GSH可用来维持细胞内的氧化还原稳态,是体内重要的一种抗氧化剂和氧自由基的清除剂,通常也被看作是评价机体抗氧化能力的一个重要的指标[14]。因此,脑卒中发生时会因为细胞内外Glu失衡而导致SLC7A11的转运活性被抑制,进而使胱氨酸在胞内的含量减少导致GSH的合成减少,氧化应激系统最终受到破坏[15]。

2.2GPX4影响脂质过氧化物堆积GSH是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸合成的一种具有抗氧化作用的三肽[16]。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)是一种依赖于GSH发挥生物活性的酶,GSH能够向GPX4传递一个电子,从而促使后者发挥其生物活性、清除组织内有害过氧化物,以及将有毒的脂质过氧化物L-OOH转化为无毒脂质L-OH的作用,可抑制脂质过氧化,是保护细胞免受氧化应激损伤的关键作用酶[17-18]。多不饱和脂肪酸(polyunsatu-rated fatty acids,PUFAs)指存在于细胞膜上含有两个或两个以上双键且碳链的长度为18～22个碳原子的一种直链脂肪酸,如花生四烯酸(arachidonic acid,AA)等,具有维持细胞膜双分子层结构通透性和流动性、降低血液中的胆固醇含量防止血液浓稠度升高的作用[19]。脑卒中发生后,SLC7A11被抑制导致GSH合成障碍,因此GPX4活性大幅度降低,PUFAs-OOH无法转化为PUFAs-OH,发生过氧化,破化了细胞膜结构完整性,最终使细胞膜损伤甚至破裂发生细胞死亡[20-21]。

3 System xc-在脑卒中后的活性调控

3.1 Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路影响System xc-的表达核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf2)是一种控制细胞氧化还原稳态和炎症的关键转录激活因子[22]。研究发现,亲电子药物或氧化应激会通过多种通路(PI3K、PKC、PERK、ERK、JNK)诱导Nrf2发生磷酸化和转录激活,然后进入细胞核发挥作用[23]。铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡,与铁依赖有关,在细胞死亡过程中通常伴随着大量的铁积累和脂质过氧化[24]。GPX4是铁死亡的关键调控因子,GSH会辅助GPX4进行合成演化。当GPX4失活或GSH耗尽时会导致脂质氢过氧化物的积累,提高脂质过氧化,并触发神经退行性变,最终导致铁死亡[25-26]。Nrf2作为转录因子可通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路上调SLC7A11和GPX4的表达,从而减少铁蛋白的堆积,保护细胞和神经元,抑制铁死亡。基于此,Yuan等研究了山奈酚能够通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制细胞神经元的凋亡,从而对脑缺血再灌注损伤的神经元细胞起到保护作用[27]。在研究中,该作者探讨铁死亡是否参与了氧糖剥夺/再复氧(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)诱导的神经元损伤,以及山奈酚对铁死亡的影响。经检测发现,OGD/R降低了神经元SLC7A11和GPX4水平,并降低了内源性抗氧化剂,包括氧化还原重要物质GSH、体内抗氧化的金属酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和影响半胱氨酸转化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),即经过OGD/R处理后增强了脂质过氧化的积累,导致神经元中出现了铁死亡。而Nrf2的抑制剂ML385阻断了山奈酚对OGD/R处理神经元抗氧化能力、脂质过氧化和铁死亡的保护作用。以上结果从正面和侧面两个角度均证实山奈酚可通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路,增强抗氧化能力,抑制脂质过氧化积累,显著逆转了OGD/R诱导的铁死亡。综上所述,铁死亡可能是与OGD/R相关的细胞死亡的一个重要原因,而山奈酚在一定程度上能够通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对OGD/R诱导的铁死亡起到保护作用,这为治疗脑卒中等神经退行性疾病以及氧化应激相关方面提供了新的诊疗思路和靶点。

3.2p53、HIF-1α转录调节因子介导System xc-的活性调控p53本质上是一种肿瘤抑制基因,其在1979年首次被发现,因其相对分子质量约为53而简称p53[28]。p53是目前公认的促凋亡基因,研究发现其能够诱导细胞生长出现停滞、衰老、凋亡等现象,在缺血性脑卒中引起的神经细胞凋亡过程中发挥了非常重要的作用,是抑制神经细胞凋亡的关键靶点[29]。编码System xc-中的跨膜转运活性蛋白SLC7A11的基因则是p53的靶基因。脑卒中发生后可促进p53的表达,此时p53的赖氨酸残基会发生乙酰化的缺陷突变,乙酰化缺陷型p53突变体会下调SLC7A11的表达,抑制System xc-的转运活性使胱氨酸摄入大幅度下降,致使依赖胱氨酸的GPX4活性降低,使细胞氧化应激系统障碍,脂质过氧化物升高并产生堆积,诱导细胞衰老甚至凋亡[30]。Khaksar等[31]施用大麻二酚对缺血性脑卒中模型大鼠进行治疗后发现,p53基因表达较治疗前下降,因此其对SLC7A11的抑制效应减弱,通过影响内在细胞凋亡、脂质过氧化的途径,在脑缺血中发挥抗细胞凋亡和抗氧化作用。综上,p53可通过影响和改善细胞的衰老、凋亡以及氧化应激系统,作为新的诊疗靶点对神经退行性疾病进行治疗,并可以更进一步的寻找SLC7A11相关靶基因作为靶向治疗位点。

缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是一种核转录因子,是介导细胞缺氧应激的关键介质,具有维持细胞内氧平衡、促进细胞黏附和增强细胞活性等多种生物学效应[32]。HIF-1α在机体缺氧的微环境下其表达量增加,并影响线粒体功能影响能量释放,诱导细胞凋亡。有研究发现,HIF-1α基因敲除小鼠在脑缺血再灌注诱导的细胞外Glu浓度升高和N-甲基-d-天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate receptor,NMDAR)激活中表现出抑制作用,即HIF-1α通过直接与其启动子结合来调节System xc-的活性表达,System xc-表达增高使得细胞内向胞外排出Glu增多,胞外高浓度的Glu会激活NMDAR,NMDAR除促进Ca2+内流外还能促进细胞外游离的Fe2+进入细胞,从而共同导致铁死亡的发生[32]。同时还发现HIF-1α可长期激活System xc-使Glu转运胞外介导兴奋性毒性作用。这些研究都表明System xc-作为治疗靶点具有广阔的前景,扩展了脑卒中可选择的治疗位点,但在另一方面说明了System xc-同时具有加重Glu的兴奋性毒性(毒性方面)和促进氧化还原(保护方面)这两方面的不同属性,关于如何把控好毒性与保护作用转换的活性节点目前尚未有相关研究,可作为今后的一个研究方向之一。

3.3BECN1自噬基因对System xc-的活性调控BECN1(Beclin1)是一种特异性的自噬基因[33]。自噬是指一个细胞吞噬其自身的成分并与溶酶体相结合,形成的自噬溶酶体用来降解包含的内容物,以维持代谢需求和能量的平衡稳态,是对机体细胞缺氧应激的适应性反应[34]。蛋白激酶AMPK是一种能量调节器,当细胞能量充足、氧化还原平衡时AMPK处于失活状态[35]。在脑卒中发生损伤能量被迅速消耗甚至枯竭的情况下,AMPK的催化亚基会被磷酸化激活,并且同时会对BECN1的ser90/93/96位点进行磷酸化,使后者与SLC7A11相结合形成Beclin1-SLC7A11复合物,直接抑制了反向转运体的活性并进一步影响机体氧化还原系统[36-37]。因此BECN1既可看作一种诱导剂,也可看作一种治疗靶点,从此入手来调节System xc-影响机体氧化还原平衡。

3.4内质网应激介导eIF2α/ATF4信号通路激活System xc-在过去10年中,越来越多的研究表明,由内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激诱导的神经元细胞死亡在调节缺血性卒中后的脑损伤中起重要作用[38-40]。脑卒中发生后引起ER功能障碍,使未折叠或错误折叠的蛋白数量增多从而堆积在内质网即ER应激。ER应激通过诱导蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)激活未折叠的蛋白质反应途径,其增加真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α,eIF2α)的磷酸化水平,并通过抑制全局蛋白质合成和激活转录因子4(activating transcription factor-4,ATF4)的选择性翻译来触发促适应性反应[41-42]。ATF4上调SLC7A11的表达,而eIF2α的磷酸化对于维持SLC7A11的基础活性十分重要[43]。还有一些体外的细胞实验发现,当培养基内缺乏胱氨酸,或其他氨基酸时,可通过eIF2α/ATF4这条通路来上调SLC7A11的表达[44]。基于以上研究基础推测,将内质网应激作为潜在靶点通过激活eIF2α/ATF4/SLC7A11信号通路是治疗脑卒中的一种治疗思路和方法,有待未来更多的基础和临床试验研究。

3.5System xc-的特异性抑制剂根据现有文献和基础临床研究发现,System xc-主要存在Erastin,索拉非尼(sorafenib),柳氮磺吡啶(sulfasalazine,SAS),谷氨酸盐这四种类型的特定抑制剂[45-48]。四类抑制剂的一个共同特点是都会直接作用于System xc-对其活性发挥抑制效应,使胱氨酸的摄入出现障碍。但目前其实验研究主要集中于对癌症的治疗,即应用抑制剂特异性作用于癌细胞使System xc-出现转运抑制,最终导致癌细胞的死亡。在脑卒中相关实验研究中仅作为抑制剂对照使用,关于其是否可以作为潜在治疗靶点还有待未来进一步更多的研究。

4 结语与展望

System xc-可调节细胞内外Glu浓度,调节Glu与胱氨酸之间的平衡,并通过胱氨酸- Cys的相互转换,实现对生成GSH的调控,调控细胞的氧化还原环境。Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路、p53促凋亡基因、HIF-1α转录因子、BECN1自噬基因、内质网应激介导eIF2α/ATF4信号通路以及SLC7A11的特异性抑制剂都会参与对System xc-活性的调控。但由于System xc-同时具有加重Glu的兴奋性毒性(毒性方面)和促进氧化还原(保护方面)这两方面的不同属性,并且其有多条可调控发生作用的信号通路以及可调控其生物活性的因子,尽管现代医学基于System xc-相关的研究发展迅速,但其在病理状态下被激活或抑制从而发挥作用的活性程度以及如何作用的详细机制还有待将来进一步的实验探究,并且其作用于多种疾病中的作用也仍需继续探索和深入研究,从而为中枢神经系统神经退行性变、肿瘤、成瘾等多种疾病的临床治疗方案奠定基础及依据,并提供新的潜在治疗靶点。综上,对于System xc-在脑卒中中的发展、诊疗和应用,仍有许多问题亟待解决,但该反向转运体本身存在巨大的研究潜能和热点,前景广阔。