过表达miR-210抑制H2O2诱导大鼠BM-MSCs成脂分化

封宝红，喻业安，晏 莉，伍 军，张艳霞，朱戈丽

武汉大学附属武汉市第三医院 肾内科, 湖北 武汉 430014

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)具有多向分化潜能，但在老年期，BM-MSCs更多地向脂肪细胞分化，可引起骨形成减少，进而导致老年性骨质疏松症[1]。目前关于BM-MSCs成脂分化相关的分子机制尚不明确，因此，探究该机制对于老年性骨质疏松症的治疗具有重要意义。研究表明，H2O2可用于诱导BM-MSCs分化，且多种miRNA参与调控H2O2诱导的BM-MSCs分化，如miR-183-5p在H2O2诱导的BM-MSCs中高表达，过表达miR-183-5p可抑制BM-MSCs成骨分化[2]。过表达miR-210可促进犬BM-MSCs向成骨方向分化[3]。此外，miR-210可参与缓解H2O2诱导产生的氧化应激损伤，改善心肌功能[4]。本研究旨在探讨miR-210对H2O2诱导的BM-MSCs成脂分化的影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性SD大鼠[广州锐格生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK(粤)2021-0059]，所有动物实验均遵循3R原则且得到武汉市第三医院动物伦理委员会的批准(ZACUC20210421-14)。

1.1.2 主要试剂：30% H2O2(上海泽叶生物公司)；过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferatior-activated receptor，PPARγ)、CCAAT/强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα)抗体(Santa Cruz公司)；抗CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5、CD90-PE流式抗体、兔源一抗β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白 D1(cyclin D1)、GAPDH及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 BM-MSCs的分离、培养[5]：采用颈椎脱位法处死大鼠，分离股骨并暴露骨髓腔，用DMEM低糖培养基反复吹打骨髓腔，将含有骨髓的培养基加入到离心管中，1 000 r/min心10 min，弃上清，将获得细胞在37 ℃、含有5% CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.2.2 流式细胞测量术检测BM-MSCs表面抗原：取汇合度90%的P3代BM-MSCs，经消化、PBS洗涤后，1 000 r/min离心10min，弃上清，调整细胞为1×106个/mL，分为8个试管，每管加入50 μL细胞悬液，并分别加入5 μL CD29 FITC-A、CD44 FITC-A、CD90 PE-A、CD45 PE-C及对应的同型对照抗体，4 ℃下避光孵育20 min，在常温下以1 000 r/min离心10 min，弃上清，利用流式细胞仪进行检测。

1.2.3 细胞的分组及处理：取增殖状态良好的P3代BM-MSCs，利用200 μmol/L H2O2诱导1 h以构建BM-MSCs成脂分化模型[6]，命名为模型组。另取正常培养的BM-MSCs为对照组。 H2O2诱导1 h后将模型组BM-MSCs进行转染，并分为mimic NC组(50 nmol/L)、miR-210 mimic组(50 nmol/L)、inhibitor NC组(100 nmol/L)、miR-210 inhibitor组(100 nmol/L)，转染24 h后观察转染效果。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测细胞中miR-210表达：用Trizol试剂提取总RNA，将RNA反转录为cDNA后，进行荧光定量PCR检测miR-210表达。以U6为内参，通过2-△△Ct法计算miR-210水平。引物序列为：miR-210正向：5′-CATAGATAGCCACTG CCCACA-3′；反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向：5′-AACGCT TTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.5 油红O染色检测细胞胞质内的脂肪颗粒：将细胞(1.0×105个/孔)接种到24孔板中，孵育24 h后，将细胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用PBS洗涤两次后，在每孔中加入500 μL油红O染色工作液染色30 min，60%异丙醇洗3次，蒸馏水洗3次，苏木精染色15 s，水洗3次，封片。观察胞质内的脂肪颗粒。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达：RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，将总蛋白经定量、电泳、转膜、封闭，将膜与一抗PPARγ(1∶2 000)、C/EBPα(1∶1 000)、β-catenin(1∶2 000)、c-Myc(1∶1 000)、cyclin D1(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃下孵育过夜，然后在室温下与二抗(1∶4 000)孵育1 h后，加入ECL试剂观察蛋白显影，通过软件(Image J)分析蛋白质条带吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BM-MSCs形态学观察及表面抗原鉴定

P0代细胞中混有杂细胞，经多次换液传代可去除，细胞贴壁较快，大部分呈长梭形。P3代细胞呈长梭形，形态及排列趋于一致，呈旋涡状增殖(图1)。P3代细胞高表达CD29(99.27%)、CD44(98.36%)和CD90(99.87%)， 低表达CD45(5.26%)(图2)。

2.2 BM-MSCs转染效率及各组BM-MSCs 中miR-210表达比较

镜下均可见较强绿色荧光(图3)。与对照组比较，模型组BM-MSCs中miR-210水平降低(P<0.05)；与模型组、mimic NC组比较，miR-210 mimic组BM-MSCs中miR-210表达升高(P<0.05)；与模型组、inhibitor NC组比较，miR-210 inhibitor 组BM-MSCs中miR-210表达降低(P<0.05)(图4)。

图1 倒置显微镜观察BM-MSCs形态Fig 1 Inverted microscope to observe the morphology of BM-MSCs

2.3 miR-210对H2O2诱导BM-MSCs成脂分化的影响

与对照组比较，模型组BM-MSCs中脂肪颗粒数目升高(P<0.05)；与模型组、mimic NC组比较，miR-210 mimic组BM-MSCs中脂肪颗粒数目降低(P<0.05)；与模型组、inhibitor NC组比较，miR-210 inhibitor 组BM-MSCs中脂肪颗粒数目升高(P<0.05)(图5)。

2.4 H2O2诱导BM-MSCs中脂肪细胞标志物PPARγ、C/EBPα 蛋白表达比较

与对照组比较，模型组BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα 蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组、mimic NC组比较，miR-210 mimic组BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组、inhibitor NC组比较，miR-210 inhibitor组BM-MSCs中PPAR γ、C/EBPα蛋白表达升高(P<0.05)(图6)。

Green represents marker expression, red represents isotype control IgG expression图2 流式细胞测量术检测BM-MSCs表面抗原Fig 2 Detection of BM-MSCs surface antigen by flow cytometry

图3 细胞转染结果Fig 3 Results of cell transfection

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group图4 miR-210在各组细胞中的表达Fig 4 Expression of miR-210 in each group of cells

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

2.5 H2O2诱导BM-MSCs中Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达比较

与对照组比较，模型组BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组、mimic NC组比较，miR-210 mimic组BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组、inhibitor NC组比较，miR-210 inhibitor 组BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达降低(P<0.05)(图7)。

3 讨论

多项研究表明，间充质干细胞对CD29、CD44、CD90呈阳性，而对CD45呈阴性，抗原CD29、CD44、CD45、CD90的表达是评估BM-MSCs纯度的重要标准之一[7]。本研究发现P3代BM-MSCs高表达CD29、CD44和CD90，低表达CD45，符合BM-MSCs的特征。氧化应激使细胞产生大量的自由基，过量自由基会导致细胞衰老，本研究通过H2O2诱导引发细胞功能异常，促进细胞脂滴形成，以构建BM-MSCs成脂分化模型，结果显示模型组BM-MSCs中脂肪颗粒数目升高，提示BM-MSCs成脂分化模型构建成功。PPARγ和C/EBPα是细胞成脂分化的关键调节因子，其可通过协同作用来调节3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化，且PPARγ和C/EBPα表达减弱可缓解H2O2诱导引发的损伤，抑制内脂滴的形成[8]；本研究显示，模型组BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα蛋白表达升高，再次证明BM-MSCs成脂分化模型构建成功。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

miRNA可调节多种生物学过程，如细胞分化、增殖和凋亡等。据报道，过表达miR-330-5p可抑制H2O2诱导的BM-MSCs成脂分化[9]；miR-210的过表达促进兔BM-MSCs 成骨分化并抑制成脂分化[10]。本研究结果与其一致：miR-210在模型组BM-MSCs中低表达，表明H2O2可引起miR-210水平降低，低水平miR-210可能与H2O2造成活性氧增多、过氧化反应增强进而对细胞造成的损伤有关；过表达miR-210后模型组BM-MSCs中脂肪颗粒数目降低，而抑制miR-210表达后则呈相反趋势，提示过表达miR-210可抑制H2O2诱导后BM-MSCs的成脂分化。

Wnt/β-catenin是一种在进化上保守的信号通路，其在调节胚胎发育和组织稳态方面至关重要。有研究发现，灌服骨碎补水煎液可以抑制去卵巢大鼠BM-MSCs成脂分化，其机制与激活Wnt/β-catenin通路有关[11]；卡马西平通过抑制Wnt/β-catenin通路增强脂肪生成[12]。本研究显示，上调miR-210表达后模型组BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达升高，而抑制miR-210表达后模型组BM-MSCs中相应蛋白表达降低，提示过表达miR-210可抑制H2O2诱导的BM-MSCs成脂分化，该机制可能与激活Wnt/β-catenin 通路有关。