结肠癌患者组织中NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107表达及其与预后的关系

戚飞飞，李广秋，冷雷

1.广州中医药大学第一附属医院白云医院中西医结合外科 广东 广州 510470；2.广州医科大学附属第一医院病理科，广东 广州 510120；3.暨南大学附属广州市红十字会医院病理科，广东 广州 510220

结肠癌在临床上主要表现为消化不良、腹胀、黏液脓性血便等[1]。近年来，结肠癌的发病率逐年上升，临床实践发现，超过60%的患者在确诊时已处于晚期，而结肠癌患者的5年生存率不足15%，预后较差[2-3]。因此，在发病初期选择能够准确鉴别结肠癌的诊断手段对于提高其临床治疗及预后都具有重要意义。

相关研究发现，Lnc RNA核受体亚家族2F组成员1-反义RNA1(Lnc RNA NR2F1-AS1)的表达与结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移有关[4]。染色体凝缩蛋白复合物I的亚基D2(NCAPD2)从属于染色体凝缩蛋白复合物I，NCAPD2通过影响其他凝缩蛋白亚基在染色体上的正常定位，进而影响细胞有丝分裂进程[5]。NCAPD2的异常表达与癌细胞的迁移、侵袭和周期转变的分子机制密切相关。核孔蛋白107(Nup 107)是Nup复合物的关键组成部分，是组装核孔复合物和mRNA输出的关键，在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多类型癌症中表现为过度表达[6]。本研究旨在探究结肠癌患者组织中NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107表达及其与预后的关系，为结肠癌患者的病情及预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年6月至2019年6月在广州中医药大学第一附属医院及暨南大学附属广州市红十字会医院进行根治性切除术的60例原发性结肠癌患者作为研究对象。纳入标准：(1)符合《NCCN结肠癌临床实践指南(2021年V2版)》[7]中关于结肠癌的相关诊治标准，均经术后病理学明确证实为原发性结肠腺癌；(2)术前无化疗、放疗等任何辅助治疗者；(3)临床病历资料齐全完整。排除标准：(1)重要脏器合并严重器质性病变者；(2)病理学检查不明确者。60例患者中男性29例，女性31例；年龄34～74岁，平均(58.18±10.50)岁；<50岁者17例，≥50岁者43例；肿瘤直径1.73～6.11 cm，平均(4.09±0.97)cm，其中<4 cm者27例，≥4cm者33例；肿瘤位于左半结肠26例，位于右半结肠34例；分化程度：高分化22例，中分化23例，低分化15例；浸润程度：T1期10例，T2期12例，T3期24例，T4期14例。转移情况：淋巴结转移38例，远端转移34例。本研究符合《赫尔辛基宣言》，经广州中医药大学第一附属医院及暨南大学附属广州市红十字会医院伦理委员会审核批准，所有患者或直系亲属均详细知情并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 Lnc RNA NR2F1-AS1检测 将所有患者的结肠癌组织标本和距离结肠癌组织>2 cm的癌旁正常组织标本置于液氮罐中冷冻保存24 h后转移至-80℃的低温环境中保存、待检。Lnc RNA NR2F1-AS1检测采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法进行：取冰冻的组织样本放置在研钵中，在液氮环境下研磨至粉末状，添加Trizol试剂(南京森贝伽生物科技有限公司)，抽提标本总RNA，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行操作。利用超微量分光光度计检测标本在260 mm、280 mm波长处的吸光度值(A)，以A260/A280比值范围在1.8～2.0提纯RNA。以2μL总DNA为模版，采用First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒(购自北京泰泽嘉业科技发展有限公司)配置逆转录反应体系，合成cRNA。之后采用SYBR Green PCR Master Mix(购自上海恪敏生物科技有限公司)配置PCR扩增反应体系，PCR扩增循环参数设置为：96℃预变性1 min，95℃变性40 s，62℃退火/延伸40 s，40个循环。Lnc RNA NR2F1-AS1(上、下游引物序列分别为：5'-CAGCGGTGCAAACCATGTGC-3'、5'-AGCAAGTTGGCTGAACCAAATG-3')以GAPDH为内参(上、下游引物序列分别为：5'-CAGTGCCAGCCTGGTCTAT-3'、5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3')。每个样本设置3个复孔，以2-△△CT法计算Lnc RNA NR2F1-AS1的相对表达量。以结肠癌患者癌组织Lnc RNA NR2F1-AS1相对表达量的平均值0.70为界限，将低于0.70的患者作为Lnc RNA NR2F1-AS1低表达组，高于0.70的作为Lnc RNA NR2F-AS1高表达组，就两组患者的临床病历资料进行分析、比较。

1.2.2 NCAPD2检测 采用免疫组化SP法检测NCAPD2蛋白表达。取结肠癌组织标本和癌旁正常组织标本进行切片，层厚4μm，60℃烤片40～60 min。采用二甲苯进行常规脱蜡，梯度乙醇水化，微波炉加热柠檬酸盐缓冲液4～8 min进行抗原修复，滴加一抗NCAPD2(1：75)，在4℃的环境中孵育过夜。次日滴加二抗，DAB显色，苏木精对比染色，中性树胶封固。阳性对照为NCAPD2阳性染色切片，阴性对照为PBS代替一抗的染色结果。结果由2名病理医师在双盲情况下进行评估，根据着色强度和着色细胞数对NCAPD2染色结果进行评价：(1)着色强度计分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)着色细胞数：阳性细胞数0%～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分相乘作为最终得分，0～1分为阴性，2～4分为弱阳性，5～7分为中度阳性，≥8分为强阳性。

1.2.3 Nup107检测 采用免疫组化法检测Nup107蛋白表达。具体步骤同NCAPD2检测，一抗为兔抗人Nup107多克隆抗体(1：100)。结果由两名病理医师在双盲情况下进行评估，根据Nup107染色结果分别赋值0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(中阳性)和3分(强阳性)，组织最终染色得分=(3×强阳性细胞百分比+2×中阳性细胞百分比+1×弱阳性细胞百分比)×100，最终染色评分范围为0～300。使用X-tile软件将Nup107表达情况分为高表达或低表达，截断值为115。

1.3 随访 术后对所有患者进行随访调查，随访时间不少于3年，每3个月至少随访一次，随访方式为院内复查和电话跟踪为主，随访起点为手术日期，随访终点为患者死亡或随访时间满3年，记录患者的术后情况，计算中位生存期。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件进行数据统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两两比较采用双侧t检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Cox回归分析Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达对结肠癌患者的影响；采用Kaplan-Meier曲线分析Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达情况与结肠癌患者预后的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织和癌旁组织的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达水平比较 结肠癌组织的Lnc RNA NR2F1-AS1相对表达量明显高于癌旁组织，结肠癌组织的Lnc RNA NR2F1-AS1高表达率、NCAPD2阳性率和Nup107高表达率明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1和图1、图2。

图1 结肠组织中NCAPD2表达免疫组化染色结果(免疫组化SP法，100×)Figure1 Immunohistochemical results of NCAPD2 expression in colon tissue(immunohistochemical SPmethod,100×)

图2 结肠组织中Nup表达的免疫组化染色结果(免疫组化SP法，200×)Figure 2 Immunohistochemical staining results of Nup expression in colon tissue(immunohistochemical SPmethod,200×)

2.2 Lnc RNANR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达与结肠癌患者临床资料的关系 Lnc RNA NR2F1-AS1高表达和低表达患者、NCAPD2阳性患者和阴性患者、Nup107高表达患者和低表达患者在肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移和远端转移方面比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2～表4。

表1结肠癌组织和癌旁组织的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达比较[±s，例(%)]Table1 Comparison of theexpression of Lnc RNA NR2F1-AS1,NCAPD2,and Nup107between colon cancer tissuesand adjacent tissues[±s，n(%)]

表1结肠癌组织和癌旁组织的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达比较[±s，例(%)]Table1 Comparison of theexpression of Lnc RNA NR2F1-AS1,NCAPD2,and Nup107between colon cancer tissuesand adjacent tissues[±s，n(%)]

组织类型结肠癌组织癌旁组织t/χ2值P值例数60 60 Lnc RNA NR2F1-AS1相对表达量1.09±0.28 0.69±0.09 10.535 0.000 Lnc RNA NR2F1-AS1低表达率33(55.00)16(26.67)9.968 0.002 NCAPD2阳性率37(61.67)18(30.00)12.118 0.001 Nup107高表达率42(70.00)19(31.67)17.638 0.001

表2 Lnc RNA NR2F1-AS1表达与结肠癌患者临床资料的关系[例(%)]Table2 Relationship between theexpression of LNC RNA NR2F1-AS1 and clinical data of patientswith colon cancer[n(%)]

表4 Nup107表达与结肠癌患者临床资料的关系[例(%)]Table 4 Relationship between the expression of NUP107 and clinical data of patients with colon cancer[n(%)]

表3 NCAPD2表达与结肠癌患者临床资料的关系[例(%)]Table 3 Relationship between expression of NCAPD2 and clinical data of colon cancer patients[n(%)]

2.3 影响结肠癌患者预后的因素 COX回归分析 结 果 显 示，Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2和Nup107表达均是结肠癌患者预后的影响因素(P<0.05)，见表5。

表5 结肠癌患者预后的影响因素COX回归分析Table 5 COX regression analysis of influencing factors of prognosis of colon cancer patients

2.4 LncRNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达与结肠癌患者预后的关系 Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，Lnc RNA NR2F1-AS1高表达、NCAPD2阳性和Nup107高表达患者的中位生存期分别低于Lnc RNANR2F1-AS1低表达、NCAPD2阴性和Nup107低表达患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6和图3～图5。

图3 结肠癌组织Lnc RNA NR2F1-AS1表达与患者预后的相关性Figure 3 Correlation between theexpression of Lnc RNA NR2F1-AS1 in colon cancer and theprognosisof patients

图5 结肠癌组织Nup107表达与患者预后的相关性Figure 5 Correlation between expression of Nup107 in colon cancer and prognosisof patients

表6 结肠癌患者的Kaplan-Meier生存曲线分析结果Table 6 Kaplan-Meier survival curve analysis results of colon cancer patients

图4 结肠癌组织NCAPD2表达与患者预后的相关性Figure 4 Correlation between NCAPD2 expression in colon cancer and prognosisof patients

3 讨论

结肠癌是临床上常见的胃肠道肿瘤，患者的病死率较高，预后较差，严重威胁患者的生存和生活质量[8]。结肠癌在发病初期缺乏典型的临床特征，尤其是发生在右半结肠的肿瘤的早期症状极不明显，多数患者在确诊时已处于晚期。早期诊断与治疗对于改善结肠癌患者的临床疗效及预后生存都极为有利[9-10]。

长链非编码RNA(Lnc RNA)是指广泛分布于血液和各大器官组织的非编码RNA分子，可参与调控个体发育、染色体重构，细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡、免疫应答等过程，在结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等众多肿瘤的发生、发展过程中能够发挥重要作用[11]。据报道，Lnc RNA NR2F1-AS1在子宫内膜癌中表达异常，在一定程度上对子宫内膜癌细胞的侵袭、迁移、凋亡等过程发挥调控作用[12]。另外，有研究结果显示，Lnc RNA NR2F1-AS1在甲状腺癌组织中表达异常，可能通过调节mi RNA-338-3p/细胞周期蛋白D1轴而促进甲状腺细胞的增殖、侵袭和凋亡等[13]。

细胞的异常增殖以及细胞周期的失衡均是影响恶性肿瘤发生、发展的关键因素。NCAPD2是染色体凝缩蛋白复合物I的亚基之一，参与了细胞有丝分裂、减数分裂的染色体组装和分离[14]，通过激活mTORC1加快细胞周期转变，抑制细胞自噬，进而促进结肠癌细胞的生长、增殖[15]。

Nup107能够介导凋亡蛋白酶激活因子1的核转位，参与了DNA损伤诱导的基因毒性应激过程[16]。Nup107的缺失导致真核细胞凋亡，干扰Nup107的表达可促使衰老细胞的生长因子信号通路减弱。据报道，Nup107能够在鼻咽癌细胞间期和有丝分裂期核孔复合物的形成中发挥重要作用，从而对肿瘤组织的增殖、侵袭、转移等过程造成一定影响[17]。本研究结果表明，发现结肠癌组织的Lnc RNA NR2F1-AS1相对表达量明显高于癌旁正常组织，结肠癌组织的Lnc RNA NR2F1-AS1表达率、NCAPD2阳性率和Nup107表达率分别为55.00%、61.67%和70.00%，均明显高于癌旁组织的26.67%、30.00%和31.67%。另外，在肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移和远端转移上，Lnc RNA NR2F1-AS1高表达和低表达患者、NCAPD2阳性患者和阴性患者、Nup107高表达患者和低表达患者均存在显著差异。上述结果表明结肠癌患者的癌细胞组织中存在NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107的过度表达，且与结肠癌患者的肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转和远处转移有关，上述标志物的过度表达可能在结肠癌的发生、发展及转移中发挥重要作用。

本研究还利用COX回归模型分析了Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表达对结肠癌患者的影响，结果显示，Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2和Nup107表达均与结肠癌患者预后不良有关。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，Lnc RNA NR2F1-AS1高表达、NCAPD2阳性和Nup107高表达患者的中位生存期分别低于Lnc RNA NR2F1-AS1低表达、NCAPD2阴性和Nup107低表达患者，结果提示结肠癌患者的NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107过度表达与不良预后有关。

综上所述，NCAPD2、Lnc RNANR2F1-AS1、Nup107在结肠癌中均有不同程度的异常表达，其异常表达与结肠癌患者的不良预后先关。检测NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107的表达情况对于结肠癌患者的早期诊断和预后评估具有一定的临床指导意义。