超声处理对牙本质玷污层性状及粘接强度的影响

王如玉，潘雅慧，聂蓉蓉，孟翔峰

在口腔修复领域，牙本质粘接一直以来都是研究的热点和难点，其粘接效果受许多因素影响[1]。其中牙本质在打磨过程中产生的玷污层是影响粘接强度的重要因素之一[2]，所以玷污层的预处理方式也是历代粘接剂改良的重点[3]。目前运用广泛的通用型树脂粘接剂通常属于弱酸型，它无法彻底去除牙本质表面的玷污层，只能部分溶解或改性，尤其是超弱酸型粘接剂作用的深度仅为几百纳米[4-5]，几乎无法在粘接界面形成树脂突，所以牙本质表面玷污层的性状会极大地影响其粘接效果。

超声技术是现代口腔治疗中一种有效的清洁方式。在牙周领域，其通过高频振荡和在水中产生的空穴效应去除菌斑牙石等附着物[6-7]；在牙体牙髓领域，通过超声荡洗可以去除根管内壁附着的玷污层及残留细菌等[8]。受此启发，如果在牙体预备后辅助使用超声器械处理牙体表面玷污层，也许有助于提高弱酸型通用树脂粘接剂与牙本质间的粘接强度。因此本研究采用了弱酸型和超弱酸型两种不同的通用型树脂粘接剂，旨在探究超声处理对离体牙牙体预备后表面玷污层性状以及粘接强度的影响，为进一步临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本院口腔颌面外科门诊收集的新鲜拔除的40颗无龋下颌第三磨牙(去除附着软组织，经消毒处理后保存在4 ℃生理盐水中，1个月内使用)；320目碳化硅砂纸(鹰牌，香港瑞新行有限公司，中国)；2种通用型树脂粘接剂：All-Bond Universal (pH=3.1，Bisco，美国)，Clearfil Universal Bond (pH=2.3，Kuraray，日本)；光固化复合树脂Z350(3M，美国)；自凝牙托粉及牙托水(沪鸽，中国)；Rhodamine B(Sigma，美国)；氰基丙烯酸酯粘接剂(Alteco，日本)。

1.2 实验设备

LED光固化灯(EliparTMDeepCure-S，3M，美国)；慢速切割机(Isomet 1000，标乐，美国)；超声洁牙机(Piezon Master 700，EMS，瑞士)；C尖(Piezon System，EMS，瑞士)；扫描电子显微镜(JEM-200CX，JEOL，日本)；激光扫描共聚焦显微镜(LSM800，ZEISS，德国)；体视显微镜(SMA1500，Nikon，日本)；微拉伸测试仪(T-61010K，Bisco，美国)；电子游标卡尺(JEM-200CX，上海精密仪器仪表公司，中国)；37 ℃生化培养箱(SPX-80，上海博泰实验设备有限公司，中国)。

1.3 牙本质表面玷污层的制备

将40颗离体牙以近中颊轴角釉牙骨质界与近中颊尖连线的上1/2处为切割点，在水流冷却条件下利用慢速切割机垂直牙体长轴切割暴露牙本质。体视显微镜下确认表面无釉质残留后，将40颗离体牙用320目碳化硅砂纸流水下打磨30 s，随机选择其中一半的离体牙继续用超声洁牙机C尖(水流速度40 mL/min，频率32 kHz)处理牙本质表面，工作尖与牙面轻接触无压力，确保超声充分且无重复，移动速度1 mm/s。处理结束后，用气枪以水喷雾方式彻底清洗牙本质表面后备用(实验流程见图1)。

图1 实验方法简略图

1.4 扫描电子显微镜(SEM)观测牙本质表面玷污层性状

分别从320目碳化硅砂纸打磨组及超声处理组中随机选取离体牙，利用慢速切割机垂直于牙体长轴切割形成2 mm厚度的牙本质薄片，固定、脱水、干燥，离子溅射器喷金后粘台，用SEM观察牙本质表面玷污层性状差异。每组随机选取3张2 000倍电镜照片，利用ImageJ软件对图片中牙本质小管暴露情况进行量化分析：牙本质小管完全暴露或暴露3/4以上评分为1.00，暴露1/2～3/4评分为0.75，暴露1/4～1/2评分为0.50，暴露1/4以下评分为0.25。利用此方法来客观评价牙本质小管暴露情况。

1.5 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观测粘接界面树脂渗透情况

Rhodamine B是由电中性、非游离分子组成的荧光染料，极易溶解于有机溶剂，能够在粘接剂中均匀分布，从而获得良好的荧光成像效果[9]，可以直观地对树脂突的数目与长度进行观测，并且不会对树脂粘接效果产生影响。将Rhodamine B(1 g/L)分别溶解于2种粘接剂中(Clearfil Universal Bond和All-Bond Universal)。从320目碳化硅砂纸打磨组及超声处理组中随机选取离体牙，按产品说明书要求分别用上述已制备好的粘接剂与复合树脂Z350进行粘接。粘接过程如下：将牙本质表面用水喷雾彻底清洗，气枪轻吹去除多余水分(不要完全干燥)，在牙本质表面反复均匀涂布粘接剂15 s，气枪吹至表面看不见流动的粘接剂，光照10 s后，分层堆塑复合树脂(Z350)，形成厚度为4 mm的树脂层，光照20 s，完成固化。粘接好的离体牙储存在37 ℃蒸馏水中。24 h后用慢速切割机将各组粘接好的离体牙沿颊舌向垂直于粘接界面切开，切成1.0 mm厚的薄片，用LSCM观察各试件粘接界面的微观形态。

1.6 样本粘接

分别将320目碳化硅砂纸打磨组(320目)及超声处理组(320目+C尖)随机分为2组，按产品说明书要求分别用All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond粘接复合树脂Z350。实验组最终分为4组即All-Bond (320目，320目+C尖)，Clearfil (320目，320目+C尖)。粘接过程如步骤1.5中所述。粘接好的离体牙储存在37 ℃蒸馏水中备用。

1.7 切割试件

利用慢速切割机将各组粘接好的离体牙切割成长方体形微拉伸试件，粘接面积约1.0 mm×1.0 mm，试件长度需≥8.0 mm(图1)。体视显微镜下排除有裂纹及粘接界面有釉质的试件后，储存在37 ℃蒸馏水中。

1.8 微拉伸粘接强度测试

利用电子游标卡尺测量试件粘接界面处的厚度(a)和宽度(b)，计算粘接面积(S=a×b)。将微拉伸试件粘固在微拉伸测试仪上，保持加载头与试件长轴在同一直线上，设置加载速度为0.5 mm/min，直至试件粘接界面断裂，此时得到最大载荷力F。微拉伸粘接强度=最大载荷力÷粘接面积。

1.9 统计学分析

利用SPSS 23.0软件，使用双因素方差分析(two-way analysis of variance)对牙本质表面处理方式和树脂粘接剂类型进行分析，并判断两者的交互作用。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 扫描电子显微镜结果

SEM结果显示(图2)，经过320目碳化硅砂纸打磨后牙本质表面玷污层划痕明显，牙本质小管几乎完全被碎屑堵塞，未见明显牙本质小管暴露；而经过C尖超声处理之后，牙本质表面玷污层划痕不明显，可见大量牙本质小管暴露。对放大2 000倍的电镜图片进行量化分析，统计牙本质小管暴露评分之和，结果显示超声处理后牙本质小管暴露评分明显增加(P<0.01)。

A：牙本质表面扫描电子显微镜图;B：牙本质小管暴露评分，**：P<0.01

2.2 树脂渗透结果

粘接剂向牙本质小管内渗透形成的树脂突性状对粘接强度影响显著，所以本实验检测了经过不同方法处理之后的牙本质表面树脂渗透情况。由图3可见，相比单纯的320目碳化硅砂纸打磨，经过C尖超声处理过后的粘接剂渗透形成的树脂突更多更长，表现在红色荧光沿牙本质小管更加渗透入牙本质深部。

图3 树脂渗透的激光共聚焦显微镜观察 ( ×40)

2.3 微拉伸粘接强度测试

所有实验组的微拉伸粘接强度结果见表1。All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond的320目+C尖组的粘接强度均显著高于各自的320目砂纸打磨组(P<0.05)。相同的牙本质表面处理条件下，All-Bond Universal和Clearfil Universal Bond的粘接强度无显著差异。

表1 通用型树脂粘接剂微拉伸粘接强度

3 讨 论

在牙本质打磨切割过程中不可避免会有玷污层的产生，它是一层由变性有机物和无机物碎屑混合血液、唾液及牙本质小管渗出液形成的不定型结构[10]，如图2所示，牙体预备后，厚而粗糙的玷污层会直接堵塞牙本质小管，常规用气枪进行水喷雾冲洗，并不能对玷污层的去除产生积极作用。有研究证明在自酸蚀粘接系统中，较厚的玷污层会中和粘接剂中的酸性单体，从而影响粘接剂向牙本质小管的渗透，降低粘接强度[2]。

当通用型树脂粘接剂采用酸蚀-冲洗方式，可以通过强酸完全去除表面玷污层，提高粘接强度，但面临着与传统酸蚀-冲洗方式相同的弊端即术后敏感、技术敏感性高等[11]。而通用型树脂粘接剂采用自酸蚀粘接模式相当于传统的一步法自酸蚀粘接剂，大多属于弱酸型(pH≈2)和超弱酸型(pH≥2.5)[12]，故本研究纳入了两种粘接剂分别为弱酸型(Clearfil Universal Bond)和超弱酸型(All-Bond Universal)，探究超声处理对不同pH值通用型树脂粘接剂粘接效果的影响。如图3所示，未经超声处理的树脂粘接界面无明显的树脂突形成，因为玷污层会中和粘接剂中的酸性单体，使得弱酸型通用树脂粘接剂对下方牙本质表面脱矿不足，阻碍其向牙本质小管的渗透以及树脂突的形成[13]。这说明虽然pH的提高使得通用型树脂粘接剂应用更加安全，但同时也存在对玷污层溶解不够、粘接强度低等问题[14]。提示通用型树脂粘接剂的自酸蚀粘接模式需要寻找一种有效的方法来处理牙本质表面玷污层，从而提高粘接性能。

超声器械作为牙周科以及牙体牙髓病科临床的常用器械，利用高频振荡以及空穴效应可以去除牙石、菌斑以及根管内残留的细菌和玷污层[15-16]。同时相对于可能会导致牙本质烧焦或者融化的激光处理，超声通过声波介导的能量相对较小且安全，在轻接触无压力的正确操作下，不会对牙本质内部造成伤害[17]。同时超声洁牙尖具有多种型号可选，C尖具有较宽的工作尖，可以增加接触面积，提升清洁效率，减小对牙面的损伤[18]。基于此理论基础，本研究利用超声器械对牙本质打磨后产生的玷污层进行处理，发现超声处理能够部分去除玷污层，暴露其下方牙本质小管(如图2A所示)。暴露的牙本质小管，有利于粘接剂对牙本质小管内部的渗透，并且牙本质表面未见明显损伤痕迹，提示C尖超声处理方式的安全性。如图3所示，本研究中利用Rhodamine B对粘接剂进行染色，清楚地显示了经过超声处理后粘接剂向牙本质深处渗透得更多更长。超声的机械荡洗作用，使得玷污层被去除或者变薄，从而有利于通用型树脂粘接剂的渗透，形成更多更长的树脂突，为提高牙本质树脂粘接强度创造了条件。

微拉伸强度结果(表1)显示经过C尖超声处理的牙本质表面，其与2种通用型树脂粘接剂间的粘接强度均得到显著提高。表1中还显示All-Bond Universal 和Clearfil Universal Bond(pH=3.1vs. pH=2.3)间粘接强度无统计学差异。所以pH值不是决定自酸蚀粘接剂性能的唯一因素，更为重要的是粘接剂的组成成分，尤其是酸性单体的种类和浓度等[19]。通用型树脂粘接剂向牙本质小管的更深渗透，形成更长的树脂突，一方面增加了粘接剂与牙本质表面间的机械结合力，另一方面，通过扩大接触面积，提高了通用型树脂粘接剂与牙本质表面间的化学结合力。本研究利用的通用型树脂粘接剂均含有酸性功能单体10-甲基丙烯酰氧癸基磷酸酯(10-MDP)。10-MDP含有磷酸基团，在氢离子的攻击下，牙本质表面浅层脱矿，10-MDP的磷酸基可与牙体中羟基磷灰石晶体(HAP)的钙离子形成稳定的结合[20]。超声处理暴露了牙本质小管口，有利于粘接剂向牙本质小管的渗透，在提高机械固位的同时，也扩大了与牙本质表面接触面积，实现10-MDP与更多的HAP钙离子产生化学结合，从而优化了通用型树脂粘接剂的双重粘接机制即“机械固位”和“化学结合”，显著提高粘接强度[21-22]。

本研究通过体外实验初步探究了超声处理对牙本质表面玷污层的影响，证实了超声振荡能够部分去除玷污层，暴露牙本质小管，增加通用型树脂粘接剂的渗透深度以及粘接强度，是一种具有临床应用潜能的方法。