沙葱萤叶甲GdHsp70-2，GdHsp70-3的克隆鉴定与表达谱分析

张宏玲, 任 浩, 田 羽, 单艳敏，王 莹, 李 玲, 李艳艳, 庞保平, 谭 瑶*

(1.内蒙古农业大学草原昆虫研究中心，内蒙古 呼和浩特 010019；2.镶黄旗草原工作站，内蒙古 镶黄旗 013250；3.内蒙古自治区林业和草原有害生物防治检疫总站，内蒙古 呼和浩特 010051；4.鄂尔多斯市自然资源局康巴什区分局，内蒙古 鄂尔多斯 017010)

沙葱萤叶甲(Galerucadaurica)属鞘翅目叶甲科，近十年来在内蒙古草原暴发成灾，主要危害百合科植物如野韭(Alliumramosum)、多根葱(Alliumpolyrhizum)、沙葱(Alliummongolium)等[1]。据调查，该虫分布于西伯利亚、蒙古高原、朝鲜半岛及中国北方多地，其一年发生1代，以卵在石块、牛粪底部越冬，于4月初开始孵化，幼虫共3龄，6月中旬开始羽化为成虫并蛰伏越夏，9月上旬解除滞育，开始取食、交配并产卵[2]。沙葱萤叶甲通过成虫滞育越夏、卵滞育越冬，以适应草原夏季极端高温、严冬极端低温的生境[2]。沙葱萤叶甲幼虫大量取食野生沙葱，致使草场植被遭到严重破坏，生产力显著下降，对当地生态环境和畜牧业可持续发展构成了严重威胁[3-4]。目前，研究者们已对沙葱萤叶甲的生长发育与遗传多样性[5-7]，滞育机制及调控机理[8-11]，化学生态系统[12-13]，杀虫剂筛选与应用[14-15]，抗寒适应性及其分子机理[16-22]等多方面开展了系统研究，为沙葱萤叶甲的绿色综合防控研究奠定了基础。

热激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)普遍存在于所有生物体中，是一类在进化上高度保守的蛋白[23]，负责在机体受逆境胁迫后保护蛋白、多肽，促进变性蛋白质修复以维持细胞稳态[24]。当昆虫受到极端温度、重金属污染、干燥、缺氧、紫外线辐射等外界刺激后，其体内HSPs可迅速合成或表达量升高[25-26]。根据相对分子质量和同源性，HSPs被分为HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、HSP40家族和小分子HSPs(sHSPs)六个家族[27]。HSP70作为生物体内最保守的热激蛋白家族，主要存在于细胞质、线粒体和内质网基质中[28-29]，依据其诱导表达特性，可分为组成型HSC70(Heat shock cognate protein 70)和诱导型HSP70(Heat shock protein 70)[30]。其中HSC70的表达相对稳定，而HSP70在各种应激条件下能迅速表达，但需要HSP40 作为协同伴侣形成“HSP70/HSP40复合物系统”共同发挥作用[31]。在生物体中不同HSP70家族成员既有相似的功能，也有各自特定功能，HSP70家族在家蚕(Bombyxmori)全基因组中被鉴定后，Fang等对其进行分类及系统发育分析，并测得在热(37℃和42℃)和冷(2℃)胁迫下，Hsp70-1，Hsp70-2和Hsp70-3的表达均上调[32]；而烟粉虱(Bemisiatabaci)经40℃热处理4 h后BtHsp70-4，BtHsp70-5，BtHsp70-6，BtHsp70-11，BtHsp70-12，BtHsp70-13基因表达量上调，但在4℃的低温处理下，除BtHsp70-10外其余Hsp70基因都被强烈诱导[33]；同样，白背飞虱(SogatellaFurcifera)在UV-A胁迫下，除Hsp70-2的表达显著下调外，Hsp70-3，Hsp70-4，Hsp70-5和Hsp70-6的表达显著上调[34]。这均表明昆虫Hsp70基因在参与应对不同环境胁迫的反应中涉及的功能不同。

前期研究已证明沙葱萤叶甲在越冬虫态及低温驯化下，编码HSP60蛋白(GdHsp60)和诱导型HSP70蛋白(GdHsp70)的基因显著高表达[18-19]，且通过RNAi沉默GdHsp60和GdHsp70基因表达显著降低了沙葱萤叶甲幼虫的抗寒能力[20]。进一步研究发现在克隆沙葱萤叶甲GdHsp70-1时，其5'端部分序列与已注册序列无法匹配，通过比对序列信息，推测该基因可能存在可变剪接。本实验应用cDNA末端快速扩增技术，对假定为GdHsp70-1的剪接异构体GdHsp70-2进行扩增测序，以明确该基因的序列信息，并进行表达谱分析；同时，对沙葱萤叶甲转录组数据中另一条注释为Hsp70的基因GdHsp70-3进行全长克隆及表达谱分析；还以沙葱萤叶甲DNA为模板对GdHsp70-2，GdHsp70-3基因组序列结构进行分析。研究结果将为深入开展HSP70在沙葱萤叶甲生长发育及抗寒性中的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫的饲养

2020年9月在内蒙古锡林郭勒镶黄旗草原(44°62′ N，115°80′ E)采集沙葱萤叶甲越冬卵，待滞育期结束后转移至温度(25±1)℃、相对湿度70%±5%、光周期14L∶10D的人工气候箱(PRX-350C，宁波海曙赛福实验仪器厂)中培养使其孵化，并以室外种植的新鲜韭菜叶片为食料进行饲养。

1.2 研究方法

1.2.1沙葱萤叶甲总RNA的提取和cDNA的合成 取沙葱萤叶甲各龄期样品20 mg，混合后按照RNAiso Plus(9108Q,TaKaRa)试剂盒说明书提取总RNA，并通过超微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度及质量；使用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(6210A,TaKaRa)将RNA反转录合成cDNA，于-20℃保存备用。

1.2.2沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3基因的克隆 根据扩增GdHsp70(Genbank登录号：KY460462)得到的测序结果和转录组中注释为Hsp70的序列信息，使用Primer 5.0软件分别设计GdHsp70-2、GdHsp70-3中间片段的上、下游引物(表1)，以1.2.1节中合成的沙葱萤叶甲cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系参照说明书。PCR反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，循环30 次；72℃ 10 min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，分离出目的条带，将其连接至pMD19-T(6013,TaKaRa)载体上，并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α(CB101,TIANGEN)中培养，筛选出阳性克隆送往生工生物公司(北京)进行序列测定。测序结果输入在线网站BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性分析。根据测序结果按SMARTer RACE 5′/3′ Kit(634858,634859,TaKaRa)说明书要求设计3′与5′的特异性引物(表1)，并采用降落PCR和巢式PCR方法进行5′和3′末端克隆，得到沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的cDNA全长序列。

表1 GdHsp70-2和GdHsp70-3基因全长克隆和荧光定量PCR引物

1.2.3序列分析及系统发育树构建 对沙葱萤叶甲GdHsp70-2，GdHsp70-3的全长序列进行生物信息学分析并构建系统发育树，所用软件名称及网址如表2所示[35-36]。

表2 基因生物信息学分析所用软件

1.2.4沙葱萤叶甲基因组DNA提取及GdHsp70-2，GdHsp70-3的内含子克隆与分析 收集沙葱萤叶甲羽化第3天的成虫100 mg，采用通用型基因组DNA提取试剂盒(DP304,TIANGEN)，提取沙葱萤叶甲基因组总DNA。根据1.2.2克隆得到GdHsp70-2，GdHsp70-3的cDNA序列设计引物(表1)，以沙葱萤叶甲总DNA为模板进行基因组分段克隆，PCR反应体系与反应条件同1.2.2。运用软件DNAstar(Version 11.0)对测序结果进行拼接，并通过在线网站GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)将拼接后的序列与来自全基因组序列比对，分析内含子序列信息。

1.2.5GdHsp70-2,GdHsp70-3的表达谱分析 对沙葱萤叶甲各发育时期及不同组织中GdHsp70-2,GdHsp70-3的表达规律进行研究。不同生育期选取各龄期蜕皮3日龄的沙葱萤叶甲虫体，每个时期取虫20头；不同组织选取3日龄沙葱萤叶甲成虫的头(含触角)、胸、腹、足(前、中、后足)、翅(前、后翅)，雌雄虫各30头。根据沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的全长序列，采用在线软件Primer 3.0(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计荧光定量PCR引物(表1)，选择沙葱萤叶甲琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDHA)基因作为内参基因[37]。q-PCR反应体系按照GoTaq®qPCR Master Mix(A6001,Promega)说明书进行配置。使用q-PCR仪(FTC-3000，Funglyn Biotech，加拿大)进行测定，反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，40个循环。采用2-△△Ct法进行相对定量分析[38]，利用SPSS 26.0软件对实验数据进行差异显著性比较分析。

2 结果与分析

2.1 沙葱萤叶甲GdHsp70-2和GdHsp70-3的克隆与序列分析

以沙葱萤叶甲的GdHsp70-1基因作为模板，通过中心片段克隆及cDNA末端快速扩增技术，扩增获得130 bp的5′端序列和一段683 bp未知序列，通过测序及同源性鉴定，认为该序列属于GdHsp70-1的剪接异构体，命名为GdHsp70-2(Genbank登录号为MZ853083)。GdHsp70-2基因全长2 410 bp，开放阅读框(Open reading frame，ORF)长1 974 bp，5′非翻译区为130 bp，3′非翻译区为306 bp，包含PolyA尾巴；编码657个氨基酸，蛋白质分子量为72.90 kD，等电点(Isoelectric point,pI)为5.07；无跨膜区，5′端含有信号肽区域，位于第1～54位残基(ATGAGGTTATATC TAAGTT TTGGTTGTGCTGCTGCTCTTAGCCAGCGTC CTGGCT)，蛋白质亚细胞定位预测GdHsp70-2主要位于细胞质内；具有3个HSP70家族特征序列，分别位于第9～16位残基(IDLGTTYS)，第197～209位残基(IFDLGGGTFDVSLL)，第334～348位残基(IVLVGGSTRIPKVQQ)，含有一个内质网特征元件，位于第629～632位残基(RDEL)(图1)。

图1 沙葱萤叶甲GdHsp70-2的碱基序列及其推导的氨基酸序列

以沙葱萤叶甲转录组数据中一条注释为Hsp70的基因作为模板，通过中心片段克隆及cDNA末端快速扩增技术，克隆获得沙葱萤叶甲GdHsp70-3(Genbank登录号为：OK585088)，其基因全长为2 242 bp，包含131 bp的5′端序列和一段170 bp的3’端序列，开放阅读框(ORF)长1 941 bp，编码646个氨基酸，蛋白质分子量为71.11 kD，等电点(pI)为5.59；未预测到跨膜区与信号肽，蛋白质亚细胞定位预测GdHsp70-3主要位于细胞核与细胞质基质内；具有3个HSP70家族特征序列，分别位于第9～16位残基(IDLGTTYS)，第197～210位残基(IFDLGGGTFDVSLL)，第335～349位残基(IVLVGGSTRIPKVQQ)(图2)。

图2 沙葱萤叶甲GdHsp70-3的碱基序列及其推导的氨基酸序列

2.2 沙葱萤叶甲GdHSP70-2和GdHSP70-3的蛋白质结构分析

利用在线分析网站SOPMA预测沙葱萤叶甲GdHsp70-2与GdHsp70-3的蛋白质二级结构，GdHSP70-2中α-螺旋(Alpha helix)占43.23%，β-折叠(Beta turn)占7.61%，无规则卷曲(Random coil)占30.59%，延伸链(Extended strand)占18.57%；GdHSP70-3中α-螺旋占41.18%，β-折叠占6.97%，无规则卷曲占33.28%，延伸链占18.58%。应用SWISS-MODEL工具建模，预测了沙葱萤叶甲GdHSP70-2与GdHSP70-3的蛋白三维结构。GdHSP70-2以牛热激同源蛋白HSC70(aa1-554)E213A/D214A突变体的晶体结构(SMTL ID：7o6r.1.A)为模板建模，相似性为66.48%(图3A)；GdHSP70-3以牛热激同源蛋白hsc70(aa1-554)E213A/D214A的晶体结构为模板建模(SMTL ID：4fl9.1.A)，相似性为78.16%。并且GdHSP70-2与GdHSP70-3的三维结构高度一致(图3B)，均由N端ATPase功能域和C端底物结合功能域所组成。

图3 沙葱萤叶甲GdHSP70-2(A)与GdHSP70-3(B)的三维结构预测模型

2.3 沙葱萤叶甲GdHSP70-2,GdHSP70-3同源比对及系统进化分析

为检测不同昆虫种间HSP70的亲缘关系，将推导出的沙葱萤叶甲GdHSP70-2和GdHSP70-3氨基酸序列，与NCBI数据库中不同目昆虫的HSP70 氨基酸序列共同构建NJ系统进化树。如图4所示，GdHSP70-2和GdHSP70-1位于同一分支，GdHSP70-2与同为鞘翅目的松墨天牛MonochamusalternatusMaltHSC70-1(GenBank登录号：QTA73204.1)亲缘关系最近，氨基酸序列相似性为91.58%；而GdHSP70-3属于另一分支，与玉米根萤叶甲DiabroticavirgiferavirgiferaDvirHSP70-2(GenBank登录号：XP_028129506.1)亲缘关系最近，氨基酸序列相似性为88.77%。已测得的3条沙葱萤叶甲Hsp70的氨基酸序列一致性为79.21%，且HSP70家族标签序列在不同昆虫种中高度一致(图5)。

图4 基于昆虫HSP70与沙葱萤叶甲HSP70的氨基酸序列构建的系统进化树

图5 基于昆虫HSP70与沙葱萤叶甲HSP70的氨基酸序列比对分析

2.4 沙葱萤叶甲GdHsp70-2，GdHsp70-3基因组DNA的结构分析

根据已经获得的GdHsp70-2，GdHsp70-3基因cDNA序列，设计引物进行基因组全长扩增，获得了GdHsp70-2，GdHsp70-3的DNA序列，经分析发现GdHsp70-2基因含有两段内含子插入(图6)，分别位于开放阅读框996～1 060位碱基(GTTAGTTCACAAG AAACTTTAATATTTTAAA CTCGTTATTTACGATTTTATTAATTTATTT TAG)与1 337～1 397位碱基(GTAAGTTATTAC AATAAAAAAGTTTTTGTACAA AAAA-ACTAATTTAATTCTTAATTTCAG)，A+T含量分别为81%与83%。而GdHsp70-3基因不含内含子，如图6所示，其中大多数Hsp70基因同样不含有内含子序列。

为了进一步了解昆虫Hsp70基因家族成员之间的进化关系，在基因组系统发育分析的基础上对其基因结构进行比较。图6显示了Hsp70可以分为四组，均具有较高的自展值，已测得的3条沙葱萤叶甲Hsp70序列均属于同一分支，其中GdHsp70-2与GdHsp70-1亲缘关系最近，而GdHsp70-3与玉米根萤叶甲DvHsp70-2(GenBank登录号：XM_028273705.1)亲缘关系最近。

图6 沙葱萤叶甲等昆虫Hsp70基因的系统发育关系及基因结构分析

2.5 沙葱萤叶甲GdHsp70-2，GdHsp70-3在不同发育阶段的表达量

沙葱萤叶甲GdHsp70-2在不同发育阶段的表达水平差异显著(F=231.59，P<0.05)(图7A)。以卵期的表达量作为对照，2龄幼虫和蛹期的表达量显著高于其它发育阶段(P<0.05)，分别是卵期表达量的7.48倍和7.75倍，而其他各龄期的表达量不存在显著差异。GdHsp70-3在不同发育阶段的表达水平差异极显著(F=657.09，P<0.001)(图7B)。以卵期的表达量作为对照，蛹期和雌性成虫中的表达量显著高于其它发育阶段(P<0.001)，分别是卵期表达量的115.32倍和8.35倍，而1，2，3龄幼虫阶段表达量极低(P<0.001)，仅为卵期表达量的4.09%，10.45%，5.80%。

图7 沙葱萤叶甲GdHsp70-2(A)和GdHsp70-3(B)在不同发育阶段的表达谱

2.6 沙葱萤叶甲GdHsp70-2，GdHsp70-3在成虫不同组织中的表达量

沙葱萤叶甲GdHsp70-2在成虫不同部位的表达量存在极显著差异(F=66.49，P<0.001)(图8A)，翅部的表达量明显高于其它部位，其次为胸部与腹部，分别为头部表达量的2.03倍、1.54倍与1.53倍；各部位GdHsp70-3的表达量也有极显著性差异(F=288.26，P<0.001)(图8B)，其中足部的表达量最高，为头部表达量的2.28倍，腹部表达量最低，仅为头部表达量的52.91%，其他部位表达量差异不显著(图8B)。

图8 沙葱萤叶甲GdHsp70-2(A)和GdHsp70-3(B)组织表达分析

3 讨论

本研究通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了两条沙葱萤叶甲Hsp70基因，分别命名为GdHsp70-2(Genbank登录号为MZ853083)与GdHsp70-3(Genbank登录号为OK585088)。使用DNAMAN(Version 8.0)对GdHsp70-2与GdHsp70-1进行序列比对，发现GdHsp70-2除5′端非翻译区及开放阅读框前端683 bp外，其余碱基与GdHsp70-1的序列相似度为99.8%，二者同源性极高，根据可变剪切的定义及剪接模式的分类[39]，推测该基因可能属于GdHsp70-1的剪接异构体。GdHsp70-1与GdHsp70-2可能是由同一mRNA前体(Pre-mRNA)通过不同的剪接方式，而产生的不同剪接异构体。这种方式使得一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物，是真核生物中增加蛋白质多样性和调控基因表达的一种常见方式，是由多种因素诱导产生的高效动态过程[40]。在蛋白质三维结构预测中GdHSP70-2与GdHSP70-3均由N-端的ATPase功能域及C-端的底物结合功能域构成，这与乔恒等对美国白蛾HyphantriacuneaHcHSP70蛋白预测的三维结构高度相似，HcHSP70的N-端ATPase功能域呈螺旋状结构，与肌动蛋白和己酮酶有类似的折叠，C-端底物结合功能域是扁平的砖状结构，具有结合延伸的多肽链通道[41]。同源比对及系统进化分析显示昆虫HSP70系统发育树被分成3支，不同目昆虫的HSP70家族基因具有较高的保守性，其中GdHSP70-2与松墨天牛MaltHSC70-1同源性相似度最高，这与早期谭瑶等的研究结果相似[19]，表明沙葱萤叶甲与松墨天牛在进化中有相近的起源关系；而GdHSO70-3与玉米根萤叶甲DvirHsp70-2同源性相似度高，说明沙葱萤叶甲不同Hsp70基因在进化上存在差异性，HSP70家族不同基因功能具有多样性[42]。

内含子(Intron)是真核生物细胞DNA中的间插序列，基因在转录后保留编码部分，间插序列经过剪接被除去，最终不存在于成熟的mRNA分子序列中[43]。随着研究的深入，内含子的功能逐渐被发掘，例如增加转录组和蛋白质组的多样性、在细胞中进行调控活动、影响基因表达、mRNA的加工、降解和翻译效率等[44]。但并非所有基因组序列中都包含内含子(图6)，吴春凤以弓形虫Toxoplasmagondii的DNA为模板，通过T-A克隆测序发现其GRA1基因为断裂基因，在原基因序列的860～861 bp间存在一段135 bp的内含子序列[45]；刘昭华根据已经获得的中华蜜蜂ApisceranaAccHsp27.6 cDNA序列进行基因组全长的扩增时，则发现该基因不含内含子[46]。本实验对两个Hsp70基因进行基因组DNA克隆，将其与从NCBI数据库中搜索来自其他目昆虫的Hsp70基因组序列构建NJ系统进化树，并分析其基因结构，但未发现Hsp70基因的编码结构与其表达形式存在必然联系，这可能是物种差异所致[47-48]。明确GdHsp70的基因结构将为应用CRISPR-Cas9基因敲除策略开展HSP70在沙葱萤叶甲生长发育[49-50]、抗寒性及相关的生物学功能研究奠定基础。

因为基因表达具有阶段特异性与组织特异性，不同时期细胞的分化和发育过程中，基因的表达会有很大差异[51]。研究报道显示Hsp70基因不仅在对抗外界压力中起主要作用，在调控昆虫生长发育及分化过程中也发挥着重要作用[52-53]。不同发育阶段表达谱显示：GdHsp70-2在2龄幼虫期和蛹期表达量较高，而GdHsp70-3只在蛹期的表达量显著高于其它各时期，表明这两个Hsp70基因可能参与了沙葱萤叶甲的生长发育过程。类似的结果在白背飞虱各发育阶段表达谱分析中也被报道，其Hsp70-2在1龄若虫中表达最高，Hsp70-3在雌虫羽化第3天达到最高表达水平，Hsp70-4，Hsp70-5和Hsp70-6在5龄第2天若虫中表达水平最高[34]。在不同组织表达量分析中，GdHsp70-2与GdHsp70-3分别在沙葱萤叶甲成虫翅和足的表达量最高，推测这两个基因可能与昆虫的运动行为相关，有助于其躲避天敌并扩大分布范围[54]，同时也反应了沙葱萤叶甲对外环境的一种适应机制。在早期谭瑶等的研究中发现，GdHsp70-1在卵期表达量远高于其他发育阶段，且不同组织中以胸部表达量最高[19]，这也表明不同的Hsp70基因在沙葱萤叶甲不同生长发育阶段中发挥着不同的作用。

4 结论

本研究通过克隆技术获得了两条沙葱萤叶甲Hsp70基因，明确其编码序列及基因结构，并对其表达谱进行分析。之后将进一步对沙葱萤叶甲Hsp70家族基因的同源性、功能与进化分析等开展深入研究，探索热激蛋白70家族不同基因在沙葱萤叶甲适应性进化方面承载的生物学功能。