非标准抗体在血清阴性抗磷脂综合征中的诊断价值*

安 然，杨树艳，刘 磊 综述，李佩玲 审校

1.哈尔滨医科大学附属第四医院妇产科，黑龙江哈尔滨 150001；2.哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，黑龙江哈尔滨 150001

抗磷脂综合征(APS)由HUGHES在1983年首次提出。APS病因复杂，可能与免疫、感染、遗传等因素相关。关于APS血栓形成的机制，目前医学界提出了“二次打击学说”[1]。抗磷脂抗体激活血管内皮细胞、血小板、单核细胞及中性粒细胞，形成“一次打击”，手术、感染、制动等因素为“二次打击”，从而诱发血栓形成。APS病理妊娠发病机制复杂，其发病机制可能为：(1)抗磷脂抗体(aPLs)可使胎盘血管收缩，减少胎盘血供。(2) aPLs抑制胎儿血管内皮细胞前列环素释放，胎儿血管收缩导致循环障碍。(3) aPLs直接与妊娠滋养细胞表面磷脂结合，破坏滋养细胞引起流产、子痫、胎儿生长受限、死胎等。抗磷脂抗体介导的免疫炎症反应是发病的主要机制。

1 抗磷脂综合征的诊断

当前APS的诊断标准采用2006年札幌国际分类标准悉尼修订版[2]。APS诊断需满足至少1项临床标准及至少1项实验室标准，且中高抗体滴度测定需间隔12周及以上。临床标准包含血管性血栓：任何组织器官出现≥1次动脉、静脉或小血管血栓形成(影像学或组织病理明确发现)，且血栓部位的血管壁无血管炎表现；病理妊娠：(1)≥1次孕10周后不明原因胎停(需经超声或直接检查证实)；(2)≥1次孕34周前因子痫/重度子痫前期或重度胎盘功能不良所致正常胎儿早产。(3)连续≥3次孕10周前原因不明流产(排除女方激素水平、解剖异常及男女双方染色体异常)。实验室标准包含(1)≥2次狼疮抗凝物阳性；(2)≥2次血清或血浆中/高滴度IgG和/或IgM型aCL(数值>40 GPL/MPL或滴度>99%普通人群)；(3)≥2次血清或血浆中/高滴度IgG和/或IgM型抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体(抗β2-GPⅠ)抗体(滴度>99%普通人群)。抗体滴度存在时间应在血栓事件发生后持续12周至5年[3]。抗体滴度持续存在的原因不明，考虑可能与感染、氧化应激有关。APS临床表现主要为血栓和/或病理妊娠。在对160例确诊APS患者的回顾性分析中，47.5%出现深静脉血栓，43.1%出现动脉血栓，9.7%出现产科并发症，2.5%出现灾难性APS[4]。此外，APS还可表现为网状青斑、血小板减少症、溶血性贫血、心脏瓣膜病、肾病及神经系统病变。目前临床常规检测的aPLs分别是抗β2-GPⅠ、aCL和狼疮抗凝物(LA)。aCL和抗β2-GPⅠ需用酶联免疫吸附试验检测(ELISA)，分为IgG型和IgM型。狼疮抗凝物是功能性凝血试验，不区分抗体同种型。

LA表现为体外低凝，体内高凝。相较于aPLs，与血栓及妊娠并发症相关性更强。LA是APS诊断最特异的检测方法[5]，无单一试验对LA完全敏感，建议同时选择两种不同分析原理试验(硅化凝血时间和稀释蛙蛇毒时间试验)，验证狼疮抗凝物的存在。

抗β2-GPⅠ是含有5个结构域(DI-DV)的高度糖基化蛋白，存在于血浆中，具有强亲脂性，参与脂代谢。抗β2-GPⅠ主要由肝细胞合成，胎盘绒毛也可合成。抗β2-GPⅠ优先结合并清除带负电荷的磷脂。这使得其与磷脂疾病及脂代谢疾病相关。抗β2-GPⅠ的DⅠ、DⅡ是其与抗体或其他蛋白结合的主要位点，在系统性自身免疫疾病和APS中，自身抗体主要识别抗β2-GPⅠ的DⅠ。抗β2-GPⅠ构象由闭合型改变为活性开放鱼钩结构，暴露DI与抗体结合、作用。抗β2-GPⅠ参与凝血、纤溶系统调节，同时作为一种生物性蛋白，参与卵巢颗粒细胞的增殖分化，调控精子生成及精子活力，与不孕及流产相关。

2 抗磷脂综合征的分类

不合并其他免疫系统疾病，以APS为首发疾病的为原发性APS(P-APS);继发于其他免疫系统疾病的为继发性APS(SAD-APS)，30.0%～40.0%狼疮患者合并APS[6]，APS还可继发于其他免疫系统疾病。以血栓为主要表现的为血栓性APS(TAPS)，以反复流产、子痫、胎盘功能不全等病理妊娠为主要临床表现的称为产科 APS(OAPS)。一些OAPS患者，仅符合APS诊断标准中的临床标准或实验室标准，或抗体间断性阳性，称为非典型 OAPS(NOAPS)[7]。多部位、多脏器迅速血栓形成，造成多器官衰竭称为灾难性APS(C-APS)。C-APS多由外科手术或感染引起。手术或感染诱发过度的促炎细胞因子、凝血级联反应和血小板活化，导致多器官、多系统血栓形成和微血管病性溶血性贫血[8]。

3 血清阴性抗磷脂综合征的定义和非标准抗磷脂抗体的临床应用

一些患者临床表现高度提示APS，但典型的aPLs,包括aCL,抗β2-GPⅠ,LA均为阴性，称之为血清阴性APS(SN-APS)。2003年首次提出SN-APS的概念。SN-APS为排除性诊断，患者需除外遗传性血栓性疾病(如凝血因子突变、蛋白S缺乏、蛋白C缺乏、抗凝血酶缺乏)、活动性癌症、创伤、遭受大手术或长期卧床等。近年研究发现多种抗磷脂抗体，为SN-APS的诊断提供了更好的依据。

一项中国队列研究[9]，实验纳入192例APS、90例SN-APS、193例自身免疫性疾病对照组和120例健康人群对照组进行评估，研究发现60.9%SN-APS和93.5%APS患者至少检测到一种非标准aPLs。

一项英-美联合研究分析了一例系列“非标准”aPLs，包括175例APS患者和68例SN-APS患者，研究发现，1/3的SN-APS患者“非标准”aPLs呈阳性。研究结论为，具有APS临床特征但常规典型标记物阴性的患者应接受额外的非标准抗体检测[10]。

GABRIELA[11]对70例原发性APS患者进行了回顾性分析，当典型抗磷脂抗体转阴5年后再次检测抗体，70例患者中有24例aPLs持续阴性。自aPLs消失并随访60个月后，24例患者中有11例(45.8%)在接受抗凝治疗后出现血栓复发。COMARMOND等[12]研究了10例aPLs转阴的APS患者，在停止口服抗凝剂后平均随访19个月，其中1例患者发生肺栓塞。故研究建议对于APS治疗后aPLs持续阴性的患者，应在停止抗凝治疗之前对患者进行非典型抗体二级筛查，同时进行彻底的心血管风险因素评估[13]。

3.1IgA 型抗磷脂抗体 IgA型aPLs 分为IgA型aCL和IgA型抗β2-GPⅠ。与IgG/IgM型aPL比，IgA-aPL的研究较少。但近年研究发现，SLE患者(伴或不伴APS)会出现IgA-aCL和IgA-抗β2-GPⅠ水平升高。IgG/IgM型aPL阴性的患者,IgA型抗β2-GPⅠ水平升高与血栓形成以及妊娠并发症相关[14]，IgA型抗β2-GPⅠ在体内具有促血栓形成作用。 有研究[15]评估430例患者的IgA、IgM、IgG型aPL。研究包含230例患者(111例APS患者和119例不合并APS的SLE患者)及200例健康对照组患者。APS患者中，IgG型aPL抗体阳性率(41.0%～74.0%)高于IgA、IgM型aPL。APS患者中，抗β2-GPⅠ 3种抗体灵敏度，IgG 型(64.8%)高于IgA型(40.5%)高于IgM 型(33.3%)；抗β2-GPⅠ 3种抗体特异度IgM 型(97.5%)高于IgA 型(97.2%)高于IgG 型(95.6%)。APS患者中IgG 型aCL、IgG 型抗β2-GPⅠ与血栓性并发症相关，与产科并发症无关。一项病例对照研究[16]包括244例IgA型抗β2-GPⅠ阳性且IgG 、IgM型阴性的患者和221例抗体均阴性的健康对照组患者，随访5年，结果表明IgA型抗β2-GPⅠ的存在与血栓性APS事件风险增加相关(OR：5.15；P<0.001)。因此，在其他aPL阴性的无症状患者中，IgA型抗β2-GPⅠ的孤立阳性似乎是发生APS事件的独立风险因素。第13届国际抗磷脂抗体大会(2010年)[17]，建议对伴有APS症状的IgG和IgM阴性患者进行IgA型抗β2-GPⅠ检测。

3.2抗磷脂酰乙醇胺抗体 磷脂酰乙醇胺(PE)构成细胞膜磷脂，主要存在于线粒体中，是一种不带电荷，数量较小的两性磷脂分子。它通过增强活性蛋白C活性而起到抗凝的作用。PE可诱导被抗磷脂酰乙醇胺抗体(aPE)识别的激肽原发生特定的构象变化，影响激肽释放酶-激肽原-激肽系统增强凝血酶诱导的血小板聚集，进而影响血栓形成及凝血功能。

一些研究发现，aPE与胎儿丢失、血栓形成显著相关，且主要存在于缺乏APS实验室标准的情况下。SANMARCO等[18]进行了研究：(1)选择98例不明原因血栓形成患者与142例血栓形成倾向患者(67例APS，75例遗传性凝血功能障碍)进行对比实验，(2)对110例无血栓患者(60例SLE，50例患感染性疾病)与健康献血者对比。本研究发现，与无血栓患者相比，APS患者(43.0%；P<0.000 1)和不明原因血栓形成患者(18.0%；P=0.001)的aPE检出率显著升高。一项大型多中心研究(包括317例深静脉血栓患者和52例动脉血栓患者)发现[19]，15.0%的血栓患者检出aPE。GRIS等[20]检测了518例不明原因早期胎儿丢失的女性和一组健康母亲的对照组中的各种aPLs。IgM-aPE被发现是不明原因孕早期流产的独立危险因素。在一项大型多中心研究中(包含317例深静脉血栓患者和52例动脉血栓患者)，15.0%的血栓患者中发现了aPE，其中大多数仅aPL阳性。aPE可被视为SN-APS潜在标志物。

3.3抗凝血酶原抗体及抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体 凝血酶原(PT)参与凝血级联反应，由肝脏合成，是一种血浆蛋白。在凝血的第二阶段由外源性凝血活酶转化为凝血酶，介导高凝状态，与血栓形成密切相关。抗凝血酶原抗体(aPT)的靶点是磷脂结合蛋白β2糖蛋白Ⅰ和PT。磷酯酰丝氨酸(PS)参与细胞膜磷脂组成，带负电荷。磷脂酰丝氨酸与凝血酶原组成磷脂-磷脂结合蛋白复合物。ELASA可检测到抗凝血酶原抗体和抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体(aPS/PT)。临床大量回顾性研究印证了aPT的临床意义。aPT在SLE患者中检出率约50.0%～60.0%，在一些研究中，其检出率甚至高于aCL、抗β2-GPⅠ。aPT增高的患者心血管意外增高5倍。aPT是诱发动脉或静脉血栓的独立风险因素。一项15年纵向研究发现，抗凝血酶原抗体是系统性红斑狼疮患者血栓形成的预测因子[21]。有研究发现[22]，血栓患者的IgG-aPT水平高于IgM-aPT。血栓患者IgG-aPT、IgG-aPS/PT和IgM-aPS/PT水平高于无血栓患者。48.0%标准抗心磷脂抗体阴性患者中可检出aPT。有研究发现[23]，包含191例抗磷脂抗体阳性携带者，40例(20.9%)中检测到IgG-aPS/PT，102例(53.4%)中检测到IgM-aPS/PT。在IgG-aPS/PT阳性携带者中，血栓性事件的累积发生率显著较高(P=0.035)，但在IgM-aPS/PT阳性携带者中则没有。有研究发现[9]，aPS/PT -IgG对APS和SN-APS诊断价值最高。IgG-aPS/PT是血栓高风险因素。ZIGON等[24]研究发现aPS/PT在抗磷脂综合征相关妊娠并发症患者中的检出率及临床相关性。结果发现24.3%的患者至少有一项抗磷脂抗体阳性，aPS/PT和aCL的检出率最高(分别为13.0%和12.4%)，其次是LA(7.7%)和抗β2-GPⅠ(7.1%)。169例有APS相关不良妊娠表现的患者中，11例仅检出aPS/PT。17.8%的患者LA或aCL和/或抗β2-GPⅠ阳性，然而，当增加检测aPS/PT时，另外7.0%的患者可以考虑APS。故aPS/PT与孕早期复发性流产或晚期妊娠丢失以及早产有关，aPS/PT现已被公认为APS的高效潜在标记物，并被纳入了全球APS评分系统(GAPSS)，用于患者血栓风险评估。aPT多与血栓形成相关，在APS患者中aPS/PT比aPT更多见。

3.4抗波形蛋白/心磷脂复合物 波形蛋白(Vimentin)是一种Ⅲ型细胞骨架中间丝蛋白，波形蛋白形成抗原后暴露，并与抗波形蛋白抗体(AVA)结合。波形蛋白还可以与凋亡细胞表面的心磷脂相互作用，产生波形蛋白/心磷脂复合物(AVA/CL)。该复合物的抗体，波形蛋白/心磷脂复合物抗体，导致内皮细胞释放促炎因子和促凝因子，诱导血小板聚集和激活凝血级联，在动脉血栓形成中起关键作用。TRUGLIA等[25]研究发现，93.9%APS患者AVA/CL 阳性，31.5%SN-APS患者AVA/CL 阳性，SN-APS患者和APS患者的AVA/CL中位数显著高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.000 1)，APS患者的AVA/CL中位数也显著高于SN-APS患者(P<0.000 1)。原发性SN-APS和继发性SN-APS患者的AVA/CL水平差异无统计学意义，且AVA/CL阳性几乎持续存在。另一项对61例产科SN-APS患者回顾性分析中发现，76.0%患者的AVA/CL呈阳性[26]。这种抗体的监测对SN-APS患者意义重大。AVA/CL检测灵敏度很高，但特异度差。类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮患者也携带此种抗体。

3.5β2-GPⅠ结构域Ⅰ抗体 抗β2-GPⅠ含有5个结构域(DI-DV)，研究发现针对抗β2-GPⅠ所有结构域抗体，其中抗D1的IgG抗体与APS关系最密切[27]。小鼠注射单克隆DI-IgG，可诱发血栓以及妊娠丢失[28]。第14界国际抗磷脂抗体大会上，专家认为APS患者中，合并血栓病史者，其抗β2-GPⅠ结构域Ⅰ(抗β2-GPⅠD1) 抗体阳性率高于无血栓者。血栓形成与结构域I抗体相关性较强，该抗体检测有助于患者风险分层及管理。血栓性APS比产科APS的抗β2-GPⅠ 结构域 I 抗体阳性率高[29]。aCL和/或抗β2-GPⅠ阳性患者中，抗β2-GPⅠ结构域I抗体存在使APS血栓风险增加3～5倍。诊断APS时IgG-抗β2-GPⅠD1抗体特异度高于IgG-抗β2-GPⅠ及IgG-aCL(分别为100.0%、96.0%、30.0%)。其灵敏度与IgG-抗β2-GPⅠ及IgG-aCL相似(分别为61.0%、63.0%、65.0%)。有研究发现，同时联合检测IgG-抗β2-GPⅠD1抗体及IgG-aPS/PT、IgM-aPS/PT将提高APS诊断的阳性预测值，并可提高发现APS血栓高风险人群[30]。另一项多中心研究31，包含抗β2-GPⅠ阳性患者442例，其中结构域I抗体阳性患者243例，研究发现IgG-aD1阳性与孕10～34周的流产、早产显著相关。故抗β2-GPⅠ 结构域Ⅰ抗体有潜力成为APS血栓及不良妊娠风险评估工具。

3.6抗膜联单白A5抗体 膜连蛋白是能与带负电荷的磷脂在钙离子存在时相结合的糖蛋白，分为A,B,C,D,E,5组，有60个成员，膜连蛋白A5(Annexin A5)目前研究较多。研究发现，膜连蛋白A5能影响花生四烯酸的代谢，阻止血栓形成，它在血管内皮细胞表面可形成保护性抗凝屏障，维持血液流通。在人内皮细胞和胎盘滋养层中高度表达。抗β2-GPⅠ抗体与抗β2-GPⅠ结合可破坏屏障，内皮细胞“抗栓”特性消失，转而聚集前炎症因子、前凝血因子等进而导致患者易栓症。SINGH等[32]将112例APS患者与40例健康对照组进行比较，发现69例APS患者抗膜连蛋白A5抗体(aANX)阳性，对照组中只有3例aANX阳性。另一项研究发现IgG-aANX与孕早期不明原因复发性流产密切相关[33]，研究尚未发现IgM亚型aANX与产科并发症的独立相关性。当IgG-aANX与多种抗磷脂抗体同时出现时，阳性抗体种类越多临床症状发生率越高。

3.7抗膜联单白A2抗体 膜连蛋白A2是A亚族成员，越来越多的研究发现膜联单白A2可以活化内皮细胞，聚集前炎症因子启动凝血瀑布反应，膜连蛋白A2同时参与纤溶活动，若受到病理因素影响，使内皮细胞表面膜连蛋白A2的表达降低，就会破坏纤溶，诱导血栓形成。膜连蛋白A2表达于内皮细胞、胎盘合体滋养层刷状缘、肾小球系膜细胞[34]。敖文[35]研究IgG型抗膜连蛋白A2抗体在APS患者、SLE合并血栓患者,无血栓SLE患者及在健康人群中的水平，研究发现APS组IgG型膜连蛋白A2 抗体阳性率为 21.8%，SLE合并血栓组IgG型抗膜连蛋白A2抗体阳性率26.8%，均显著高于无血栓的SLE 组(6.5%)(均P<0.01)。膜连蛋白A2 抗体IgG阳性的患者血栓和/或不良妊娠的概率显著高于A2抗体阴性者(P<0.01)。故抗膜连蛋白A2抗体与血栓及不良妊娠相关，且有助于APS诊断。

3.8抗磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇抗体 磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇 (PI)均为带负电荷的磷脂，对血清阴性抗磷脂综合征的诊断作用存在争议。一项中国地区研究发现IgG型抗磷脂酰肌醇抗体(aPI)与动脉血栓显著相关,IgG和IgM型抗磷脂酰丝氨酸抗体(aPS)均与动脉血栓显著相关，但与静脉血栓无关[36]。体外模型中研究发现，PS可抑制胎盘滋养层的发育和侵袭，延缓合体滋养层的形成，降低HCG水平[37]。一项对866例抗心磷脂抗体阴性的复发性流产患者的研究发现，10.1%的患者存在其他抗磷脂抗体阳性，其中包括抗磷脂酰丝氨酸(PS)。此类患者应用低分子肝素或普通肝素治疗后分娩率升高[38]。另一项对872例复发性流产的研究发现，49例患者(3.6%)aCL及LA均阴性，但aPS阳性，aPS的存在与复发性流产呈正相关。

4 总结和展望

抗磷脂综合征的尽早诊断及治疗对预防不良妊娠及血栓性疾病的发生极其重要。临床表现满足APS而三大血清学抗体阴性的患者，亟需新的检测方法。对SN-APS患者的研究，促进了新的特异性标记物的发现，越来越多的临床研究证明新标记物的临床价值。本文发现，IgA 型抗磷脂抗体与血栓相关；抗磷脂酰乙醇胺抗体与孕早期不明原因流产、血栓及产科并发症相关；抗凝血酶原抗体与血栓形成相关，是静脉或动脉血栓形成的独立风险因素；抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体与孕早期复发性流产或晚期妊娠丢失以及早产相关，并且与血栓相关；抗波形蛋白/心磷脂复合物与血栓及产科并发症相关；抗β2-GPⅠ 结构域Ⅰ抗体与血栓形成相关性较强，有助于风险分层和患者管理，且与妊娠10～34周流产、早产相关，抗β2-GPⅠ 结构域 I 抗体有潜力成为APS血栓及不良妊娠风险评估工具；抗膜联单白A5抗体与血栓及不明原因复发性流产相关；抗膜联单白A2抗体与血栓及不良妊娠相关；抗磷脂酰丝氨酸IgG/IgM型抗体与动脉血栓显著相关，可能与不良妊娠相关；抗磷脂酰肌醇IgG型抗体与动脉血栓显著相关，可能与不良妊娠相关；抗磷脂酸抗体可能与不良妊娠相关。

对反复出现不明原因血栓形成、不明原因复发性流产或反复妊娠相关并发症的女性，临床高度怀疑APS，但aPLs滴度间断阳性或持续阴性，考虑可能为SN-APS的患者，可行相关非标准抗体检查，且检查发现的非标准抗体数目越多，血栓、不良妊娠等疾病发病风险越高。APS患者典型抗体持续阴性，在中断抗凝治疗之前，强烈建议对患者进行非典型抗体二级筛查，同时进行彻底的心血管风险因素评估。对于APS的诊断，非标准抗磷脂抗体是对现行aPLs标准的重要补充。但由于各实验室检测方法及标准不同，导致非标准抗磷脂抗体实验结果偏差，这就需要将实验室检测方法标准化，同时需要开展多中心、不同种族、大样本、更规范的临床研究。非标准抗体存在巨大潜在价值。