复合植物营养素对育肥小尾寒羊瘤胃发酵参数、瘤胃菌群及背最长肌脂肪酸组成的影响

王 园 王文文 杨 毅 高 畅 郭 焘 段 婷 刘 娜 安晓萍 齐景伟*

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心，呼和浩特 010018；3.安徽科技学院，动物营养调控与健康安徽省重点实验室，滁州 233100)

近些年，为了保护生态环境以及发展的需要，肉羊育肥方式已从放牧向集约化舍饲转变。在集约化快速育肥条件下，肉羊长期采食高精料饲粮，瘤胃微生物区系改变，瘤胃发酵异常，导致机体患病和肉品质下降[1]。大量科学研究已经证实，在育肥饲粮中加入植物提取物可以调控瘤胃菌群的结构，影响瘤胃发酵，促进机体健康[2]。作为在畜禽生产中广泛应用的植物提取物，丁香酚、肉桂醛以及辣椒油树脂均可调控动物肠道菌群结构，进而改善机体健康状况[3-5]。本课题组在先前的研究中已表明，发酵麸皮多糖可调控杜寒杂交肉羊瘤胃菌群结构，提高瘤胃组织中紧密连接蛋白的mRNA表达，有利于维持瘤胃健康[6]。目前关于单一营养素对肉羊瘤胃菌群结构的影响研究很多，但关于复合添加各种营养素对肉羊瘤胃菌群结构的影响研究很少。因此，本试验将发酵麸皮多糖与肉桂醛、丁香酚、辣椒油树脂等添加剂做成复合植物营养素(compound plant nutrients，CPN)，添加到育肥小尾寒羊的饲粮中，旨在探究CPN对其瘤胃菌群结构、瘤胃发酵参数及背最长肌脂肪酸组成的影响，以期为CPN应用于反刍动物生产中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 CPN

CPN由内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心研制，主要成分为发酵麸皮多糖(≥50%)、丁香酚(≥1.5‰)、肉桂醛(≥0.9‰)和辣椒油树脂(≥0.6‰)，辅料为沸石粉等。

1.2 试验设计与饲养管理

试验选取健康且体重[(24.18±0.31) kg]相近的4月龄小尾寒羊母羊16只，并随机分为2组，每组8个重复，每个重复1只羊。对照组饲喂基础饲粮，而试验组饲喂在基础饲粮中加入了3‰ CPN的试验饲粮。基础饲粮根据《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制，其组成及营养水平见表1。基础饲粮为全混合颗粒饲料，直径为6 mm，长度为10 mm，由内蒙古某有限公司提供。试验期为97 d，预试期7 d，正试期90 d。本试验在内蒙古巴彦淖尔市临河区肉羊试验基地进行，常规饲养管理，每日定时饲喂(08:00和17:00)，每天根据前1 d的剩料量重新调整饲喂量，保证料槽中每天有10%左右的剩料。自由饮水。单栏饲养。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

续表1项目Items含量Content石粉Limestone1.50豆油Soybeanoil1.00预混料Premix1)2.10合计Total100.00营养水平Nutrientlevels2)代谢能ME/(MJ/kg)9.62干物质DM91.56粗蛋白质CP14.56粗脂肪EE3.95粗灰分Ash7.67中性洗涤纤维NDF38.44酸性洗涤纤维ADF14.92钙Ca0.76磷P0.48

1.3 样品采集

试验结束后，采用清真屠宰法屠宰所有羊只，立即收集新鲜瘤胃液，经4层纱布过滤后采集瘤胃液样本50 mL，部分用于现场测定瘤胃pH，另一部分加入4 mL 0.2 mol/L盐酸溶液混匀，用于测定瘤胃氨态氮(ammonia nitrogen,NH3-N)浓度，剩余瘤胃液用于挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)浓度测定，-20 ℃冷冻保存。同时采集未过滤瘤胃食糜2 mL，液氮速冻，-80 ℃保存，用于瘤胃细菌Illumina-Nova测序分析。此外，取羊右侧倒数第1、2根肋骨处背最长肌样品200 g，-20 ℃冷冻保存，用于肌肉脂肪酸组成的测定。

1.4 瘤胃发酵参数的测定

瘤胃pH采用便携式酸度计(Starter 2100型，OHAUS公司，美国)测定。NH3-N浓度参照冯宗慈等[7]比色法测定。瘤胃VFA(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸)含量采用气相色谱仪(Clarus680型，Perkin Elmer公司，美国)测定。瘤胃液样本前处理：样本解冻后，取50 μL样本，用50%甲醇稀释40倍后，再取50 μL，加入50 μL内标和50 μL衍生试剂，常温衍生30 min，加入50 μL保护剂，再加入250 μL水，涡漩振荡10 s，13 200 r/min离心10 min，取上清检测。气相色谱条件为：Elite-FFA型毛细管柱(30 m×0.25 mm)；柱温120 ℃；FID检测器温度25 ℃；氮气流速30 mL/min。

1.5 Illumina-Nova测序分析

1.5.1 瘤胃食糜总DNA的提取、扩增及测序

利用Power Fecal®DNA提取试剂盒(MoBio Carlsbad,美国)提取小尾寒羊瘤胃食糜样品中微生物的总DNA，针对16S rDNA的V4区(515f：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806r：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，设计合成特异引物，进行扩增。扩增片段的测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司按照标准流程运用Illumina NovaSeq平台完成。

1.5.2 生物信息学分析

测序所得的原始序列，首先使用FLASH(V1.2.7)进行拼接，参照Qiime(V1.7.0)进行质量控制，得到有效序列。利用Uparse软件(v7.0.1001)对所有样品的有效序列以97%的一致性进行操作分类单元(OTU)聚类，用Mothur软件与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1.0)，在门、属水平下统计每个样品的菌群组成。各样品的数据经过均一化处理后，采用Qiime软件进行Alpha多样性和Beta多样性分析。

1.6 背最长肌脂肪酸组成的测定

小尾寒羊背最长肌脂肪酸含量采用气质联用(7890B-5977A,安捷伦公司,美国)外标法测定。气相色谱条件为：DB-23毛细管色谱柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，进样体积1 μL，进样口温度250 ℃，分流比1/5；检测器温度230 ℃，载气：氦气；柱箱温度50 ℃，1 min，25 ℃/min 到175 ℃，4 ℃/min到230 ℃，24.75 min。

1.7 统计分析

瘤胃发酵参数和背最长肌脂肪酸组成数据使用SAS 9.2软件进行t检验分析，试验结果以平均值和均值标准误(SEM)表示，而菌群数据进行非参数t检验分析。育肥小尾寒羊瘤胃菌群(属水平)与背最长肌脂肪酸含量进行Spearman相关性分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃发酵参数的影响

由表2可知，与对照组相比，饲粮中添加CPN对瘤胃pH、总挥发性脂肪酸浓度、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸及异戊酸的含量和乙丙比无显著影响(P>0.05)，但能显著降低育肥小尾寒羊瘤胃液NH3-N浓度(P<0.05)。

表2 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃发酵参数的影响Table 2 Effects of CPN on rumen fermentation parameters of finishing small tail Han sheep

2.2 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃菌群结构的影响

2.2.1 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃菌群Alpha多样性指数和Beta多样性的影响

如图1-A～图1-E所示，与对照组相比，添加CPN对育肥小尾寒羊瘤胃菌群Alpha多样性指数(ACE、Chao1、Observed_species、Shannon和Simpson指数)均无显著影响(P>0.05)。如图1-F显示，主成分1(PC1)的贡献率为57.45%，主成分2(PC2)的贡献率为19.30%，此结果说明对照组与试验组的瘤胃菌群结构有一定的差异。

R1:对照组；R2:试验组。下图同。R1：control group;R2:test group.The same as below.图1 Alpha多样性和Beta多样性分析Fig.1 Analysis of Alpha and Beta diversity

2.2.2 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃菌群丰度的影响

如图2所示，与对照组相比，试验组瘤胃食糜中拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著降低(P<0.05)[44.48% vs 29.05%]，酸杆菌门(Acidobacteriota)的相对丰度显著增加(P<0.05)[1.92% vs 3.10%]。

Fibrobacterota：纤维杆菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Actinobacteriota：放线菌门；unidentified_Bacteria：未分类菌门；Spirochaetota：螺旋菌门；Acidobacteriota：酸杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Chloroflexi：绿弯菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Verrucomicrobiota：疣微菌门。图2 MetaStat分析(门水平)Fig.2 MetaStat analysis (phylum level)

如图3所示，与对照组相比，试验组瘤胃食糜中普雷沃氏菌属(Prevotella)的相对丰度显著降低(P<0.05)[33.64% vs 18.99%]，而柔膜菌科UCG-002(Erysipelotrichaceae_UCG-002)[0.55% vs 1.19%]、乳杆菌属(Lactobacillus)[0.34% vs 0.87%]及巨型球菌属(Megasphaera)[0.19% vs 0.43%]的相对丰度显著增加(P<0.05)。

Acidothermus：热酸菌属；Ruminococcus：瘤胃球菌属；Olsenella：奥尔森菌属；Fibrobacter：纤维杆菌属；Prevotella：普雷沃氏菌属；Bacteroides：拟杆菌属；Pseudomonas：绿脓杆菌属；Prevotellaceae_Ga6A1_group：普雷沃氏菌科Ga6A1群；Sphingomonas：鞘氨醇单胞菌属；Lachnospiraceae_NK3A20_group：毛螺菌科NK3A20群；Treponema：密螺旋体菌属；[Eubacterium]_ruminantium_group：啮齿真杆菌属群；Succiniclasticum：解琥珀酸菌属；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9肠道群；Syntrophococcus：互营球菌属；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Acetitomaculum：醋酸杆菌属；[Ruminococcus]_gnavus_group：发光球菌属群；Succinivibrionaceae_UCG-001：琥珀酸弧菌科UCG-001；Escherichia-Shigella：埃希氏-志贺菌属；Blautia：布劳特氏菌属；Erysipelotrichaceae_UCG-002：柔膜菌科UCG-002；Saccharofermentans：产酸糖酵菌属；Dialister：小杆菌属；Megasphaera：巨型球菌属；Lactobacillus：乳杆菌属；Succinivibrio：琥珀酸弧菌属；Faecalibacterium：栖粪杆菌属。图3 MetaStat分析(属水平)Fig.3 MetaStat analysis (genus level)

2.3 CPN对育肥小尾寒羊背最长肌脂肪酸组成的影响

由表3可知，试验组中育肥小尾寒羊背最长肌肉中单不饱和脂肪酸(MUFA)总量、C14∶1、C16∶1及C18∶1n9含量与对照组相比总体呈现下降趋势，分别降低了8.14%、33.33%、21.28%、7.55%，但无显著差异(P>0.05)；但试验组中育肥小尾寒羊背最长肌肉中多不饱和脂肪酸 (PUFA) 总量、C18∶2n6c、C18∶3n6、C18∶3n3、C20∶2、C20∶3n6、C20∶4n6及C20∶5n3的含量与对照组相比总体呈现增加趋势，分别提高了30.77%、26.82%、27.27%、9.52%、19.05%、35.48%、51.39%，但无显著差异(P>0.05)。此外，试验组中育肥小尾寒羊背最长肌肉中n-3高度不饱和脂肪酸总量和n-6高度不饱和脂肪酸总量与对照组相比总体呈现增加趋势，分别提高了13.64%和31.53%，但无显著差异(P>0.05)。

表3 CPN对育肥小尾寒羊背最长肌脂肪酸组成的影响Table 3 Effects of CPN on fatty acid composition of longissimus dorsi muscle of finishing small tail Han sheep %

2.4 育肥小尾寒羊瘤胃菌群与背最长肌脂肪酸指标之间的相关性

由图4可知，背最长肌中C18∶1n9c含量与Megasphaera和Erysipelotrichaceae_UCG-002相对丰度呈显著负相关(P<0.05)；MUFA总量与Erysipelotrichaceae_UCG-002相对丰度呈显著负相关(P<0.05)；C14∶1含量与解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)相对丰度呈显著正相关(P<0.05)；C16∶1含量与Succiniclasticum相对丰度呈显著正相关(P<0.05)。

由图5所知，背最长肌中C18∶2n6c、C18∶3n3及n-3PUFA含量与Succiniclasticum相对丰度呈显著负相关(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃发酵参数的影响

瘤胃pH和VFA含量是衡量瘤胃发酵状况及健康程度的重要指标[8]。本试验结果显示，饲粮中添加3‰ CPN对育肥小尾寒羊瘤胃pH、TVFA浓度、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸及异戊酸含量和乙丙比均无显著影响。王金光[9]研究结果发现，添加2.5和5 g/kg的CPN均可降低杜寒杂交肉羊瘤胃中TVFA的含量，但对pH、各种VFA占比和乙丙比无显著影响。这表明CPN对小尾寒羊瘤胃pH和VFA含量无显著影响，这可能与本试验中CPN的添加剂量和肉羊品种有关，需要进一步研究。反刍动物瘤胃内的NH3-N主要是由于饲粮中的含氮化合物的脱氨基作用所形成，是反映瘤胃内氮代谢水平的主要指标之一。瘤胃内NH3-N浓度和微生物对饲粮中蛋白质的降解和利用机制相关[10]。本试验中，试验组NH3-N浓度为5.08 mg/dL，对照组为11.76 mg/dL，均在适宜范围内，且试验组NH3-N浓度低于对照组，表明饲粮中添加CPN能够提高瘤胃微生物对氮的利用速率。与本试验结果一致，Wang等[11]研究发现，作为CPN的主要成分，发酵麸皮多糖也可降低早期断奶羔羊瘤胃中NH3-N的浓度。

MUFA:单不饱和脂肪 monounsaturated fatty acid;Sphingomonas：鞘氨醇单胞菌属；Acidothermus:热酸菌属；Megasphaera：巨型球菌属；Sharpea：夏普氏菌属；Syntrophococcus：互营球菌属；Lachnospiraceae_NK3A20_group：毛螺菌科NK4A136群；Succiniclasticum：解琥珀酸菌属；Blautia：布劳特氏菌属；Acetitomaculum：醋酸杆菌属；Escherichia-Shigella：埃希氏-志贺菌属；Pseudomonas：绿脓杆菌属；Lactobacillus：乳杆菌属；Fibrobacter：纤维杆菌属；Olsenella：奥尔森菌属；[Ruminococcus]_gnavus_group：发光球菌属群；Erysipelotrichaceae_UCG-002：柔膜菌科UCG-002；X[Eubacterium]_ruminantium_group：啮齿真杆菌属群；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9肠道群；Succinivibrio：琥珀酸弧菌属；Saccharofermentans：产酸糖酵菌属；Dialister：小杆菌属；Ruminococcus：瘤胃球菌属；Prevotellaceae_Ga6A1_group：普雷沃氏菌科Ga6A1群；Faecalibacterium：栖粪杆菌属；Bacteroides：拟杆菌属；Treponema：密螺旋体菌属；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Succinivibrionaceae_UCG-001：琥珀酸弧菌科UCG-001；Prevotella：普雷沃氏菌属。*表示显著相关 * mean significant correlation。下图同 the same as below。图4 瘤胃菌群(属水平)与背最长肌单不饱和脂肪酸指标的相关性Fig.4 Correlation between rumen bacteria (genus level) and MUFA indices in longissimus dorsi muscle

3.2 CPN对育肥小尾寒羊瘤胃菌群结构的影响

瘤胃菌群可以直接影响营养物质的消化利用，而饲粮是影响瘤胃菌群结构和组成的关键因素[12]。研究表明，植物提取物具有调控瘤胃菌群结构的作用[2]。本试验发现，添加CPN对育肥小尾寒羊瘤胃菌群Alpha多样性指数均无显著影响，但可影响Beta多样性，此结果说明CPN可以在一定程度上改变育肥小尾寒羊瘤胃菌群结构。在门和属水平上，添加CPN可增加Acidobacteriota、Erysipelotrichaceae_UCG-002、Lactobacillus和Megasphaera的相对丰度，并降低Bacteroidetes和Prevotella的相对丰度。Lactobacillus作为一种常见的益生菌，其可通过产生VFA来降低肠道pH，改善肠道菌群结构[13]。Megasphaera是瘤胃中最主要的乳酸分解菌，瘤胃中超过70%以上的乳酸可被其利用，其酵解乳酸产物主要为丙酸、丁酸以及少量的乙酸和戊酸[14-15]。关于本试验发现的Acidobacteriota和Erysipelotrichaceae_UCG-002，前人研究中对其功能的描述较少，未来需要进一步探究。Erysipelotrichaceae_UCG_002属于厚壁菌门(Firmicutes)中的柔膜菌科(Erysipelotrichaceae)类，其与VFA合成密切相关[16]。基于上述研究推测，CPN组育肥小尾寒羊瘤胃中Lactobacillus和Megasphaera相对丰度的增加，有利于为机体提供更多的VFA，且可预防瘤胃酸中毒。研究发现，Prevotella可以产生大量的复合酶，进而可加速降解淀粉，且高淀粉饲粮会使其相对丰度增加[17-18]。本研究中，Prevotella相对丰度的减少可能是因为CPN(发酵麸皮多糖、丁香酚、肉桂醛和辣椒油树脂)的成分为非淀粉类物质，无法为Prevotella的增殖提供底物。Prevotella属于Bacteroidetes，本试验中Bacteroidetes相对丰度的降低可能主要是Prevotella的相对丰度的降低导致的。

PUFA：多不饱和脂肪酸polyunsaturated fatty acid。图5 瘤胃菌群(属水平)与背最长肌多不饱和脂肪酸指标的相关性Fig.5 Correlation between rumen bacteria (genus level) and PUFA indices in longissimus dorsi muscle

3.3 CPN对育肥小尾寒羊背最长肌脂肪酸组成的影响

羊肉风味、嫩度和多汁性等特性主要受肌肉脂肪酸的组成和含量的影响[19]。研究表明，栗木单宁可以增加滩羊肌肉中MUFA和PUFA的含量，提高肌肉的营养价值[20]。本试验发现，CPN处理对育肥小尾寒羊背最长肌的脂肪酸组成无显著影响。郭焘等[21]试验研究表明，饲粮中添加2.5 g/kg CPN可增加杜×寒杂交母羔背最长肌中C16∶1、C17∶1、C18∶1n9c及MUFA含量，但可降低C18∶2n6c、C18∶3n6及C20∶3n6含量。试验结果不一致可能与CPN的添加剂量和肉羊品种有关，需要进一步研究。研究表明，摄食富含PUFA的肉类可通过降低胆固醇和低密度脂蛋白含量来降低心脏疾病风险[22]。本试验中，CPN添加组中背最长肌PUFA、C18∶2n6c、C18∶3n6、C18∶3n3、C20∶2、C20∶3n6、C20∶4n6及C20∶5n3的含量与对照组相比总体呈现增加趋势，这在一定程度上有利于消费者健康。Liotta等[23]研究发现，迷迭香提取物中含有的酚类物质可以终止氧化链反应并提高PUFA合成过程中Δ-5去饱和酶及Δ-6去饱和酶的活性，这可提高猪肉中PUFA的含量。因此，本试验中PUFA含量的变化可能是CPN中的丁香酚在发挥作用。

3.4 育肥小尾寒羊瘤胃菌群与背最长肌脂肪酸指标之间的相关性

羊肉中PUFA的含量与其在瘤胃内的氢化程度有关，而瘤胃菌群主要参与PUFA在瘤胃中的氢化过程[24]。本试验发现，背最长肌中C18∶1n9c含量与Megasphaera和Erysipelotrichaceae_UCG-002相对丰度呈显著负相关；MUFA总量与Erysipelotrichaceae_UCG-002相对丰度呈显著负相关；C14∶1含量与Succiniclasticum和Ruminococcus相对丰度呈显著正相关；C16∶1含量与Succiniclasticum相对丰度呈显著正相关；背最长肌中C18∶2n6c、C18∶3n3含量及n-3PUFA总量与Succiniclasticum相对丰度呈显著负相关。同时添加CPN可增加Erysipelotrichaceae_UCG-002和Megasphaera的相对丰度。由此推测，CPN可能通过调控育肥小尾寒羊瘤胃菌群结构，增加了Erysipelotrichaceae_UCG-002和Megasphaera的相对丰度，减少了瘤胃氢化，增加了PUFA在羊肉中的沉积。然而，关于这些变化菌种在脂肪酸代谢过程中的具体作用都还需进行深入细致的研究。

4 结 论

饲粮中添加CPN可降低育肥小尾寒羊瘤胃NH3-N浓度，增加Acidobacteriota、Erysipelotrichaceae_UCG-002、Lactobacillus和Megasphaera的相对丰度，并降低Bacteroidetes和Prevotella的相对丰度。