复合酶法提取对黑果腺肋花楸不溶性膳食纤维结构及功能特性的影响

秦续缘，程志强，于寒松

（吉林农业大学，吉林 长春 130118）

黑果腺肋花楸原产于北美，因其营养价值高而备受关注。20世纪90年代，我国引入黑果腺肋花楸，并相继在辽宁、吉林、黑龙江等省市发展种植。王鹏等[1]研究表明，黑果腺肋花楸的果实富含还原糖、有机酸、花青素、黄酮和维生素等营养成分，而且黑果腺肋花楸还可用于酿造果酒、酿制保健醋、生产固体果茶。随着人们对黑果腺肋花楸果实营养价值认识的提高，其加工产品也有了较好的发展前景。由于黑果腺肋花楸被大量开发和使用，产生了大量副产物——黑果腺肋花楸果渣，而这些果渣不宜储存和运输，大部分被丢弃，造成了严重的资源浪费和环境污染。经过大量研究发现，黑果腺肋花楸果渣中含有丰富的营养物质，如膳食纤维、花青素、蛋白质、黄酮醇、多酚类化合物等[2]。因此，对黑果腺肋花楸果渣的有效利用不仅可以减轻对环境的影响，还可以提高黑果腺肋花楸副产物的附加值。

国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）将纤维定义为具有超过10个单体单元的聚合物，并且其不会被人体小肠中的消化酶分解。膳食纤维（dietary fiber，DF）是指从植物细胞壁中提取的一系列非消化性营养物质，它们在人体小肠中不易被消化和吸收，在大肠中能完全或部分发酵，主要有纤维素、半纤维素、木质素、果胶、树胶、低聚糖和其他多糖。根据其在水中的溶解性，膳食纤维通常分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）[3]。IDF 能使食物快速在消化系统运动，同时增加粪便体积，有益于便秘人群[4]。流行病学研究表明，高膳食纤维摄入量可以降低某些疾病（如心血管疾病、结肠癌和直肠癌）的发病率。糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌、憩室炎、痔疮等多种疾病以及肥胖也均与纤维摄入量密切相关[5]。

目前，复合酶法、化学法、酶化学法、超声辅助法和微波辅助法提取IDF的途径多种多样，不同的加工条件可能会改变IDF的成分和结构特征，从而影响IDF的功能和理化活性[6]。IDF的生理功能取决于其纤维基质结构、理化性能和功能性能以及粒度[7]。本文采用复合酶法提取黑果腺肋花楸中IDF，并进一步比较提取的IDF功能活性和理化活性，以期为黑果腺肋花楸衍生膳食纤维的研究提供思路，为黑果腺肋花楸的深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸：采自长白山；大豆油：市售；淀粉葡萄糖苷酶（100 000 U/g）、中性蛋白酶 60 000 U/g）、高峰α-淀粉酶（40 000 U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Agilent 7890）、离心机（KL04-A）：美国 Agilent公司；破壁机（XBLL-S01）：中国西贝乐公司；扫描电镜（SSX-550）、傅里叶红外光谱仪（model IR Prestige-21）、示差检测器（RI-10A）：日本Shimadzu公司；鼓风干燥箱（叶拓101系列）：上海叶拓仪器仪表有限公司；酶标仪（HBS-1096B）：美国Molecular Devices公司；色差分析仪（CR-5）：美能达投资有限公司；磁力搅拌器（ZNCL-G）：郑州予华仪器制造有限公司。

1.3 IDF的提取

1.3.1 黑果腺肋花楸的初步处理

将黑果腺肋花楸去梗，用破壁机打碎、过滤，分离果渣和果汁，在25℃室温下，将样品于95%乙醇中搅拌2 d，以去除游离糖。抽滤后在干燥箱（60℃）中干燥24 h。将干燥样品进行研磨，80目筛筛分，得到黑果腺肋花楸果渣（Aronia melanocarpa pomace，AMP），然后将黑果腺肋花楸果渣保存在干燥器中备用。

1.3.2 复合酶法提取IDF

IDF 的提取参考 Wang 等[6]、Hua 等[8]的方法，稍作修改。取5 g果渣粉（试样样品差＜0.005 g）置于1 000 mL锥形瓶中，加入蒸馏水250 mL。向试样液中加入0.5 mL高峰α-淀粉酶液，置于95℃恒温振荡水浴中持续振摇35 min，打开铝箔，用刮勺轻轻地将附着于锥形瓶内壁的胶状物刮下，并用少量水冲洗瓶壁。之后试样液置于60℃水浴中，加入1.5 mL中性蛋白酶溶解液，盖铝箔，持续振摇30 min，用6 mol/L NaOH或6 mol/L HCl溶液调节pH值至4.50±0.02，加入2 mL淀粉葡萄糖苷酶酶解，继续于60℃水浴中持续振摇30 min，提取液于5 000 r/min离心15 min，提取的残余物用蒸馏水漂洗2次并冷冻干燥以获得IDF。

1.4 膳食纤维微观结构和形态

为探究酶对膳食纤维结构的影响，使用扫描电镜对膳食纤维样品的微观结构和形态进行检测。具体步骤：样品台用无水乙醇擦洗，之后将样品覆盖在导电胶体上，轻轻敲打样品台，使样品单层铺于样品台表面，喷金处理后置于扫描电镜观察台，并在1 000倍和4 000倍的放大倍数下观察微观结构[9]。

1.5 傅里叶变换红外光谱测定

取干燥好的样品粉末，采用溴化钾压片法制备样品，获得厚约1 mm、直径约为10 mm的薄片。在4 000 cm-1～400 cm-1对压片进行扫描，获得样品的红外吸收光谱[10]。

1.6 单糖组成的测定

采用Dionex ICS-5000+系统，以Carbo PACTM PA20（2.0 mm×150 mm）阴离子交换柱为分析柱，脉冲安培检测器为检测器，利用梯度洗脱方法进行测定。称量10 mg样品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L三氟乙酸10 mL，120℃水解3 h。准确吸取酸水解溶液至试管中氮气吹干，加入10 mL水涡旋混匀，吸取100 μL酸水解溶液加入900 μL去离子水，12 000 r/min离心5 min。将上清液进行高效液相色谱分析。

1.7 功能性质的测定

1.7.1 持水性（water holding capacity，WHC）的测定

根据Yu等[11]的方法进行持水性的测定。将1.0 g IDF样品加入至25 mL蒸馏水中，静置24 h。5 000 r/min离心10 min，立即倒掉上清液，提取残留物，并测量其质量。持水性的计算公式如下。

WHC/（g/g）=（W2-W1）/W1

式中：W1为 IDF 样品质量，g；W2为残留物质量，g。

1.7.2 持油性（oil holding capacity，OHC）的测定

在室温（25℃）条件下，将1 g样品加入至25 mL大豆油中，静置24 h。5 000 r/min离心10 min后立即倒掉上清液，提取沉淀物，然后立即测量其质量。持油性的计算公式如下。

OHC/（g/g）=（O2-O1）/O1

式中：O1为 IDF 样品质量，g；O2为残留物质量，g。

1.7.3 水膨胀能力（waterswellingcapacity，WSC）的测定

参考He等[12]的方法检测样品的水膨胀能力，稍作修改。具体方法：称取0.5 g样品，倒入25 mL量筒中，与20 mL蒸馏水充分混合均匀，在室温（25℃）下静置24 h。记录静置前和静置后体积，样品的WSC表示样品水膨胀后的体积变化，其计算公式如下。

WSC/（mL/g）=（V1-V）/0.5

式中：V1为静置后的体积，mL；V为静置前的体积，mL；0.5 为样品质量，g。

1.7.4 亚硝酸根离子吸附能力（nitrite ion adsorption capacity，NIAC）的测定

将0.1 g样品与5 mL 10 μg/mL NaNO2溶液混合，并分别将pH值调节至7.0和2.0以模拟小肠和胃环境。然后将混合溶液在37℃水浴锅中静置3 h，4 800 r/min离心10 min，取0.4 mL上清液于试管中。根据刘静娜等[13]的方法，进行反应，之后使用色差仪进行测定。亚硝酸根离子吸附能力的计算公式如下。

NIAC/（mg/g）=（C1-C2）×0.005/Μ

式中：C1、C2分别为吸附前、后上清液中NaNO2的浓度，mg/L；M 为样品质量，0.1 g；0.005 为 NaNO2溶液的体积，L。

1.7.5 葡萄糖吸附能力（glucose adsorption capacity，GAC）的测定

参考Wu等[14]的方法进行测定，稍作修改。具体方法：取1 g样品加入至100 mL的50、100、150 mmol/L葡萄糖溶液中，然后在37℃水浴锅中搅拌6 h。将混合物5 000 r/min离心10 min，取上清液0.5 mL于离心管中。根据Wang等[15]的方法，使用二硝基水杨酸盐显色试剂测定上清液中葡萄糖水平来计算样品葡萄糖吸附量（GAC），计算公式如下。

GAC/（mmol/g）=（C3-C4）×0.1/Μ

式中：C3、C4分别为吸附前、后上清液中葡萄糖水平，mmol/L；M 为样品质量，1 g；0.1 为葡萄糖溶液体积，L。

1.8 统计分析

所有试验数据测定3次并利用Origin 2018软件处理数据、作图；采用SPSS 20软件进行显著性分析（P＜0.05），结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 AMP和IDF的微观结构

利用扫描电镜观测复合酶法提取黑果腺肋花楸不溶性膳食纤维显微结构。图1为AMP和IDF的扫描电镜图。

图1 AMP和IDF的电镜图Fig.1 Electron micrograph of AMP and IDF

膳食纤维的功能特性和结构特性，主要由其内部结构和表面性质决定[14]。由图1可知，AMP表面较为平整且大颗粒较多，可能是由于蛋白质和脂肪含量过高，其与纤维以结合形式或游离形式存在，并进一步聚集成团，相比之下IDF的微观结构出现明显的变化，结构出现层次，颗粒数量也有所减少，并且在相同放大倍数下，粒径较APM小，这可以解释IDF比AMP具有更强的持水性、持油性、亚硝酸根离子吸附和葡萄糖的吸附能力[16]。扫描电镜结果表明，提取方法可能会改变黑果腺肋花楸膳食纤维的功能特性。

2.2 傅里叶变换红外光谱分析

图2为傅里叶红外光谱，可以分析不同官能团的光谱特征。

图2 IDF和AMP的红外光谱Fig.2 Infrared spectra of IDF and AMP

由图2可知，IDF和AMP在吸收峰上没有明显变化，均在3 400 cm-1附近出现一个较宽的吸收峰，是典型的纤维素和半纤维素的O-H伸缩振动带，说明分子间存在氢键作用力；在2 900 cm-1附近出现的较弱吸收峰，主要为糖类甲基和亚甲基上的C-H基团伸缩振动吸收峰[17]。IDF在1 652 cm-1的吸收峰可能是苯环的特征吸收峰，在1 048 cm-1处出现的较强吸收峰，是纤维素和半纤维素中醚键（C-O-C）的伸缩振动吸收峰[18]，这些区域的吸收峰均来自IDF的特征吸收峰。IDF的峰形没有明显变化，表明提取后主要成分没有变化，IDF的活性成分在处理过程中没有被破坏。

2.3 单糖组成分析

IDF的单糖组成如图3所示。

图3 IDF的单糖组成Fig.3 Composition of IDF monosaccharides

由图3可知，IDF含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸7种单糖。其中单糖含量最高的是木糖（45.3%），说明黑果腺肋花楸膳食纤维中含有较多的木聚糖半纤维素，而木糖是无热量甜味剂，市场上可以将木糖应用于无糖食品的开发，适合肥胖和糖尿病患者食用。阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖的含量也相对较高。其中阿拉伯糖（低热量甜味剂）能够抑制小肠中蔗糖酶活性、延缓血糖升高、降低血清中葡萄糖含量。半乳糖醛酸多数为甲酯，是果胶酸的组成单位，也是果胶的主要成分，而IDF中的半乳糖醛酸含量较高，也表明复合酶法可以使部分可溶性膳食纤维转化为不溶性膳食纤维，从而提高不溶性膳食纤维的得率。

2.4 功能性质测定结果

2.4.1 持水性、持油性和水膨胀能力测定结果

IDF和AMP的持水性、持油性和水膨胀能力结果如表1所示。

表1 IDF和AMP的持水性、持油性和水膨胀能力Table 1 Water holding capacity，oil holding capacity and water swelling capacity for IDF and AMP

持水性是指受到外力作用时保持原有水分的能力，膳食纤维的持水性不仅影响滋味、香气、营养成分、颜色等食用品质，而且还直接影响膳食纤维制品的成品率，较低的持水性会给膳食纤维产品带来较大的经济损失。而持水性越高，膳食纤维的生理活性越好。膳食纤维的持水性、持油性与亲水部位的化学性质、数量以及IDF的表面积、密度和结构有关[19]。由表1可知，IDF的WHC 为（3.59±0.10）g/g，较AMP有所增加，表明复合酶法提取使AMP的分子形态发生改变，暴露出更多极性基团等可与水分子结合的位点，提高了IDF的持水能力，同时，与IDF的微观结构也密切相关。

IDF的持油性在各种食品应用中发挥着至关重要的作用，如加工食品的过程中防止脂肪流失；人体食用后其吸附大量脂肪后排出体外。膳食纤维与油脂的结合能力取决于IDF的表面性质和纤维颗粒的疏水性[20]。IDF 的持油性显著强于 AMP（P＜0.05），持油性分别为（3.28±0.11）g/g和（1.52±0.14）g/g。这可能是由于提取过程中的复合酶提高了IDF和油脂之间的接触面积，使其对油的保持能力增强。

在压强、温度保持恒定的情况下，待测样品不断吸水，体积不断增加即为膨胀性。水膨胀性是衡量膳食纤维功能特性的重要指标之一。黑果腺肋花楸IDF具有较高的膨胀能力，可归因于其纤维密度低，且通过红外光谱可以看出其支链含有极性基团和糖醛酸基团。由表 1可知，IDF的水膨胀能力为（3.15±0.08）mL/g，显著高于AMP的水膨胀能力（P＜0.05）。结果表明，复合酶法提取可以使黑果腺肋花楸的功能特性增加，而这些功能特性在食品中有良好的应用前景。

2.4.2 亚硝酸根离子吸附能力测定结果

IDF和AMP的亚硝酸根离子吸附能力如图4所示。

图4 IDF和AMP的亚硝酸根离子吸附能力Fig.4 Nitrite ion adsorption capacity of IDF and AMP

硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于人体环境中，是自然界中最常见的含氮类化合物。人体内硝酸盐在胃酸作用下可被还原为亚硝酸盐、N-亚硝基化合物的前体物质。内源性亚硝化条件下摄入的硝酸盐或亚硝酸盐被列入2A类致癌物清单[21]。从图4可以看出，IDF在pH2.0环境下的NIAC比pH7.0环境下有所增加，说明膳食纤维对NO2-的吸附发生在胃中，肠中基本不吸附NO2-。pH2.0时，IDF的亚硝根离子吸附能力（51.20±0.12）mg/g显著高于 AMP 的（40.10±0.23）mg/g（P＜0.05），表明复合复合酶法提取的膳食纤维对NO2-表现出更好的吸附作用，但仍低于采用微波方法提取的葡萄柚子的IDF亚硝酸根离子吸附量[（219.43±0.02）mg/g][17]，因此，研究不同提取方法之间吸附能力的差异具有重要意义。而Dong等[22]研究表明，膳食纤维对亚硝酸盐吸附效果是通过分子上的-OH和NO2-形成“膳食纤维-NO2-”络合物来实现NO2-的去除，碱性条件下该络合物解离，并随粪便排出。

2.4.3 葡萄糖吸附能力测定结果

图5为IDF和AMP的葡萄糖吸附能力。

图5 IDF和AMP的葡萄糖吸附能力Fig.5 Glucose adsorption capacity of IDF and AMP

研究发现，IDF含量较高的食物，如绿藻、竹笋等，可以延缓或减少消化道对葡萄糖的吸收，具有较好的降血糖能力[23]。因此，吸附葡萄糖也是IDF的一个重要功能性质。由图5可知，IDF和AMP对葡萄糖均有吸附效果，并且吸附量随葡萄糖浓度的增加而增加，IDF的吸附效果分别为（1.54±0.12）、（1.97±0.13）mmol/g和（2.88±0.15）mmol/g，对比发现酶解作用使吸附葡萄糖的能力显著增强（P＜0.05），这可能是因为复合酶对部分细胞壁的降解作用，使纤维结构变得疏松、溶胀，暴露出更多的功能基团，溶质分子更容易进入纤维内部，膳食纤维与葡萄糖分子间和分子内作用力（如范德华力和氢键等）的相互作用增强，能够吸附更多的葡萄糖分子。结果表明，IDF能够吸附葡萄糖从而减少或降低葡萄糖在体内的吸收速率，因此，其可以有效缓解糖尿病人对葡萄糖的吸收速率，控制血糖的上升。

3 结论

本研究采用复合酶法提取黑果腺肋花楸膳食纤维，并对其组成和功能特性进行表征。结果表明，提取方法不仅影响IDF的结构特征，还影响其功能特性。采用复合酶法提取的黑果腺肋花楸IDF的质量有了很大的提高，在功能食品工业中具有较大的应用潜力，值得进一步研究。综上，对黑果腺肋花楸IDF的单糖组成进行研究，不仅反映了复合酶法对细胞壁结构的影响，也从多糖结构的角度揭示黑果腺肋花楸膳食纤维具有保健功能特征，为活性物质资源的开发、利用提供新的重要信息。