反溶剂诱导法和pH驱动法对姜黄素的增溶及稳态化

王永辉，汪新月，郭卫芸，高雪丽，李光辉*，孙思胜，黄继红

（1.许昌学院食品与药学院 河南 许昌 461000；2.河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南 许昌 461000）

在食品加工中，姜黄素被广泛作为调味剂、防腐剂和着色剂等使用[1-2]。姜黄素具有酚羟基和甲氧基的结构特征，具备与活性氧和氮反应的能力[3-4]，其对正常细胞毒性低，但是可诱导多种肿瘤细胞系死亡[5-8]。姜黄素还具有作为营养补充剂治疗关节炎等炎症疾病的作用[9-10]，以及具有抗菌、抗氧化、抗动脉粥样硬化和抗纤维化等多重作用[2-3]。姜黄是一种极具功能食品开发价值的药食同源物质，其主要有效活性成分为姜黄素，但是姜黄素难溶于水，化学结构稳定性差，受外界环境影响也比较大，而且在肠道中代谢快，生物利用率低[11]。研究表明，pH值、盐离子、温度以及溶液极性等改变后可以诱导分子间发生组装，形成纳米级、具有一定几何外形的胶体颗粒[12]。通过诱导蛋白质与姜黄素的非共价络合作用，两者共组装形成的纳米级胶体颗粒能够极大地改善姜黄素的水溶性及稳定性。当前报道的诱导方法主要有pH驱动法、喷雾干燥法、液体反溶剂沉淀法、凝聚法等[13]。

反溶剂诱导法通过向溶液中加入非溶剂而引起溶质过饱和，从而为溶质的沉淀提供驱动力，同时为了维持纳米颗粒的稳定性，溶液中通常还要有表面活性剂的存在[14]。pH驱动法通过转变溶液的pH值诱导生物大分子发生“解离－重构”及“去质子化-质子化”[15]，实现将游离态姜黄素包埋于大分子内部。Dai等[16]利用大豆卵磷脂和玉米醇溶蛋白，通过反溶剂共沉淀制备了姜黄素复合纳米颗粒，明显提高了姜黄素的水溶性及稳定性。Chen等[17]通过反溶剂诱导法制备了姜黄素复合纳米颗粒溶液，使姜黄素的稳定性和生物可利用率得到明显提高。Pan等[18]通过pH驱动法获得了具有良好复溶性的姜黄素复合纳米颗粒。Xu等[19]通过pH驱动法制备了姜黄素复合纳米颗粒，姜黄素在酸性环境下的分散性及稳定性均得到提高。这两种制备方法均能够有效提高姜黄素的溶解性以及稳定性，但由于不同研究间存在试验原料以及含量的差异，无法对这两种制备方法进行对比分析，因此这两种制备方法的优劣尚缺乏具体研究。

单纯蛋白质构建的姜黄素纳米复合物在弱酸性食品体系中的稳定性较差。研究表明，通过构建蛋白/多糖/姜黄素三元复合物可以解决姜黄素复合物纳米颗粒在弱酸性环境下的稳定性问题[20]。可溶性大豆多糖（soluble soybean polysaccharides，SSPS）属于水溶性膳食纤维，是一种良好的乳化稳定剂，其在酸性环境下具有独特的稳定蛋白质的能力。研究表明，将SSPS作为稳定剂可明显提高蛋白质/姜黄素复合纳米颗粒在酸性环境下的稳定性[21]。本研究以酪蛋白酸钠为载体，通过反溶剂诱导法和pH驱动法分别制备姜黄素复合物，对比分析两种制备方法对姜黄素增溶能力的影响，并考察姜黄素复合物在不同温度及不同贮藏时间下的稳定性，本研究还进一步分析酪蛋白酸钠（sodium caseinate，NaCas）复配SSPS后两种制备方法对姜黄素增溶能力及其酸性环境稳定性的影响。本研究旨在对比分析反溶剂诱导法和pH驱动法对姜黄素的增溶能力及稳定性的影响，为姜黄素在功能食品的应用中提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姜黄素（纯度≥92%）、NaCas（纯度≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SSPS（纯度≥98%）：河南万邦实业有限公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（FA 2014 B）：上海越平科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-7504）：上海新茂仪器有限公司；磁力搅拌器（ZNCL-DL）：爱博特科技有限公司；电热恒温水浴锅（DK-8D）：常州普天仪器制造有限公司；酸度计（PB-10）：德国 Sartorius公司；高速冷冻离心机（JW-2019HR）：安徽嘉文仪器装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 反溶剂诱导法制备姜黄素复合物

参考Wang等[21]的方法制备姜黄素复合物，并略作修改。用去离子水配制5mg/mLNaCas储备液，于4℃冰箱放置4 h。将0.4 g姜黄素加入40 mL无水乙醇，充分搅拌后在4℃离心（8 000 r/min、8 min）除去沉淀，将获得的姜黄素乙醇溶液（10 mg/mL）置于4℃冰箱避光保留备用。取NaCas储备液10 mL置于15 mL具塞玻璃瓶中，20℃室温下，通过磁力搅拌器在1 000 r/min的搅拌速度下，逐滴加入0.5 mL姜黄素乙醇溶液，并持续搅拌10 min。随后，将上述混合物在4℃离心（8 000 r/min、8 min）除去沉淀，上清液即为姜黄素复合物溶液。用去离子水将上清液稀释40倍，并在425 nm下测初始吸光度。对照组用去离子水替代NaCas溶液，制备过程同上。

1.3.2 pH驱动法制备姜黄素复合物

参考Pan等[18]的方法制备姜黄素复合物，并略有修改。用去离子水配制5 mg/mL NaCas储备液，于4℃冰箱放置4 h。取NaCas储备液10 mL置于15 mL具塞玻璃瓶中，加入5 mg姜黄素粉末，用4 mol/L NaOH溶液将pH值调整为12.0。在室温（20℃）下，通过磁力搅拌器在1 000 r/min的转速下搅拌10 min后，用4 mol/L HCl溶液将溶液的pH值调整为7.0。将该溶液在4℃、8 000 r/min条件下离心8 min除去沉淀，上清液即为姜黄素复合物溶液。用去离子水将上清液稀释40倍，并在425 nm下测初始吸光度。对照组用去离子水替代NaCas溶液，制备过程同上。

1.3.3 不同贮藏温度下姜黄素复合物稳定性的测定

将两种方法制备的姜黄素复合物溶液分别在4、20、50℃ 下放置 30 min，4℃、8 000 r/min离心 3 min后除去沉淀。将上清液用去离子水稀释40倍后，在425nm下测吸光度，计算保留率。保留率为不同温度放置后测定的吸光度与初始吸光度的百分比。

1.3.4 不同贮藏时间下姜黄素复合物稳定性的测定

将两种方法制备的姜黄素复合物溶液分别置于4℃避光放置，每隔12 h取2 mL，4℃、8 000 r/min离心3 min，除去沉淀，将上清液用去离子水稀释40倍后，在425 nm下测吸光度，计算溶液中姜黄素的保留率。保留率为不同放置时间测定的吸光度与初始吸光度的百分比。

1.3.5 不同酸性环境下姜黄素复合物稳定性的测定

用去离子水将两种方法制备的姜黄素复合物溶液分别稀释10倍后，将其均分为6份，用0.5 mol/L的盐酸将上述溶液的 pH 值分别调整为 7、6、5、4、3、2。将不同pH值的姜黄素复合物溶液分别在4℃离心（8 000 r/min、3 min），上清液用去离子水稀释40倍后，在425 nm下测吸光度，计算保留率。保留率为不同pH值下测定的吸光度同pH值为7时吸光度的百分比。

1.3.6 添加SSPS后姜黄素复合物溶解能力的测定

在NaCas储备液中加入0.5%的SSPS，经磁力搅拌充分溶解后，分别采用1.3.1中的反溶剂诱导法和1.3.2中的pH驱动法制备姜黄素复合物。用去离子水将复合物溶液稀释40倍，并在425 nm下测吸光度。

1.3.7 添加SSPS后姜黄素复合物在酸性环境下稳定性的测定

将加入SSPS后经两种方法制备的姜黄素复合物溶液均稀释40倍，然后均分为6份，用4 mol/L的HCl溶液分别调 pH 值为 7、6、5、4、3、2。在 4 ℃离心（8 000 r/min、3 min），测定上清液在425 nm的吸光度，并计算保留率。保留率的计算方法同1.3.5。

1.4 数据分析

每项试验均进行3次独立测定，结果以平均值±标准差表示。利用SPSS 19.0进行单因素方差分析（p＜0.05），用 Origin 8进行作图。

2 结果与分析

2.1 两种方法对姜黄素增溶作用的比较

制备方法对姜黄素复合物吸光度的影响见图1。

图1 制备方法对姜黄素复合物吸光度的影响Fig.1 Effects of preparation methods on curcumin complexes

由图1可知，在利用NaCas同姜黄素非共价结合制备姜黄素复合物的过程中，反溶剂诱导法和pH驱动法对于姜黄素的增溶效果差异显著（p＜0.05）。相对于pH驱动法，在相同NaCas浓度下反溶剂诱导法对姜黄素的增溶能力可提高近4倍。产生这一结果的原因可能在于pH驱动法在实施过程中产生较多的盐离子，盐离子的存在降低了姜黄素复合颗粒的表面电荷，从而使颗粒失去稳定性，进而导致姜黄素溶解性的降低。研究表明，高盐离子对姜黄素复合颗粒的胶体稳定性非常不利[20]。另外，在没有NaCas存在的去离子水中，两种制备方法对姜黄素的增溶效果差异不显著（p＞0.05），姜黄素的溶解能力均非常低。这一现象同Chen等[17]、Pan等[18]以及Wang等[21]的研究结果较为一致。

2.2 不同环境条件对姜黄素复合物稳定性的影响

2.2.1 贮藏温度对姜黄素复合物稳定性的影响

姜黄素复合纳米颗粒胶体溶液是一种热力学不稳定的体系，温度对其稳定性的影响较大[20]。贮藏温度对不同方法制备的姜黄素复合物保留率的影响见图2。

图2 温度对不同方法制备的姜黄素复合物保留率的影响Fig.2 Effects of temperature on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由图2可知，两种方法制备的姜黄素复合物溶液随着贮藏温度的提升，姜黄素的保留率均出现下降的趋势。这说明温度的升高导致姜黄素复合纳米颗粒的胶体稳定性下降，部分颗粒出现了聚集沉淀，导致溶液中的姜黄素含量降低。另外，温度较高时会导致部分姜黄素发生降解，从而使姜黄素的保留率进一步降低。有研究指出，贮藏温度越高，姜黄素越不稳定，当温度高于40℃时，姜黄素会发生明显的分解[22]。当温度为4℃时，两种方式制备的姜黄素复合物均具有较高的保留率，两者之间差异不显著（p＞0.05）。在室温（20℃）时，反溶剂诱导法制备的姜黄素复合物稳定性要优于pH驱动法。当处理温度为50℃时，虽然姜黄素的保留率均出现大幅下降，但pH驱动法制备的姜黄素复合物较反溶剂诱导法制备的姜黄素复合物的稳定性更佳。

2.2.2 贮藏时间对姜黄素复合物稳定性的影响

贮藏时间对不同方法制备的姜黄素复合物保留率的影响见图3。

图3 贮藏时间对不同方法制备的姜黄素复合物保留率的影响Fig.3 Effects of storage time on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由图3可知，随着贮藏时间的延长，两种方法制备的复合物溶液中姜黄素的保留率均呈明显下降的趋势。但在相同的贮藏时间下，两种方法制备的姜黄素复合物的保留率差异显著（p＜0.05）。pH驱动法制备的姜黄素复合物溶液贮藏12 h后，姜黄素的保留率不足70%。而反溶剂诱导法制备的复合物溶液中姜黄素的保留率仍高达95%。贮藏时间为48 h时，反溶剂诱导法制备的复合物溶液中姜黄素的保留率仍在80%左右，而pH驱动法中姜黄素的保留率仅有约50%。产生这一结果的原因同样应归因于pH驱动法中有大量盐离子的引入，造成溶液的离子强度较高，从而降低了姜黄素纳米颗粒的贮藏稳定性。因此，在相同的贮藏时间下，反溶剂诱导法制备的姜黄素复合物溶液具有更高的稳定性。

2.2.3 溶液pH值对姜黄素复合物稳定性的影响

当溶液的pH值靠近蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解性迅速下降，造成蛋白质诸多功能性质（乳化性、凝胶性及起泡性）丧失[23]。pH值对不同方式制备的姜黄素复合物保留率的影响见图4。

图4 pH值对不同方式制备的姜黄素复合物保留率的影响Fig.4 Effects of pH values on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由图4可知，随着溶液pH值的降低，姜黄素在溶液中的保留率呈先明显降低后趋于平稳的趋势。当溶液的pH值为6时，反溶剂诱导法制备的姜黄素复合物保留率显著高于pH驱动法（p＜0.05）。但随着溶液pH值的进一步下降，两种方法制备的复合物中姜黄素的保留率差异不显著（p＞0.05）。当溶液的pH值为4时，姜黄素在上清液的保留率均仅有10%左右。产生这一现象的原因在于当溶液的pH值降低到酪蛋白酸钠的等电点时，蛋白溶解能力下降，发生聚集沉淀造成姜黄素发生共沉淀。另外，研究结果还表明，两种方法制备的姜黄素复合物在低pH值环境下稳定性均较差，具有相同的趋势。

2.3 添加SSPS后不同制备方法对姜黄素的增溶作用

添加SSPS后不同制备方法对姜黄素复合物吸光度的影响见图5。

图5 添加SSPS后不同制备方法对姜黄素复合物吸光度的影响Fig.5 Effects of SSPS on the light absorption value of curcumin complexes prepared by different methods

由图5可知，无论是反溶剂诱导法还是pH驱动法，NaCas中复配SSPS后的吸光度均显著高于单纯的NaCas（p＜0.05）。原因可能为 SSPS是一种糖蛋白，其含有的蛋白能够同姜黄素发生结合，从而形成更多的姜黄素复合物。另外，对于NaCas/SSPS复合体系，同单纯的NaCas体系类似，反溶剂诱导法对姜黄素的增溶能力仍然明显高于pH驱动法，前者仍约是后者的4倍。说明相对于NaCas，SSPS对姜黄素的增溶能力非常有限。

2.4 添加SSPS后姜黄素复合物在酸性环境下稳定性

SSPS是一种酸性阴离子多糖，其在食品加工中可作为一种重要的蛋白质稳定剂。SSPS能够在蛋白颗粒周围形成一层保护层，当溶液的pH值在蛋白的等电点附近时，蛋白颗粒仍能均匀地分散在溶液中，保持较为稳定的状态。相关研究表明，SSPS可以明显提高蛋白质稳定的姜黄素复合物在酸性环境下的稳定性[19-21]。复配SSPS对姜黄素复合物在酸性环境下稳定性的影响见图6。

图6 复配SSPS对姜黄素复合物在酸性环境下稳定性的影响Fig.6 Effects of compound SSPS on the stability of curcumin complexes in the acidic environment

由图6可知，溶液pH值的改变对复合物中姜黄素保留率存在较大影响。随着溶液pH值的降低，两种方法制备的复合物中姜黄素保留率均出现明显下降的趋势，但两者下降的幅度存在明显的区别。pH值小于7时，反溶剂诱导法制备复合物的姜黄素保留率显著高于pH驱动法对应的保留率（p＜0.05）。对于反溶剂诱导法制备的复合物溶液，随着pH值的降低，姜黄素保留率下降趋势较为平缓，基本保持在80%以上。但是pH驱动法制备的复合物姜黄素保留率随pH值的下降呈现出近直线下降的趋势，pH值为2时仅有10%。因此，通过pH驱动法制备蛋白质姜黄素复合物时，引入SSPS并不能改善复合物在酸性环境下的稳定性。但是，通过蛋白复配SSPS，并利用反溶剂诱导法制备则可以改善其在酸性环境的稳定性。

3 结论

利用食品组分的相互作用，通过制备胶体复合物可有效改善姜黄素的溶解性及稳定性。结果表明，反溶剂诱导法和pH驱动法两种方式均可制备姜黄素复合物，并能够显著提高姜黄素的溶解能力与稳定性。相对于pH驱动法，反溶剂诱导法在相同浓度条件下能更好地增加姜黄素的水溶性，其增溶效果约是前者的4倍。NaCas溶液中添加SSPS后再通过反溶剂诱导法制备的姜黄素复合物能够更好的提高姜黄素水溶性及其在酸性环境的稳定性。因此，反溶剂诱导法能够对姜黄素起到更好的增溶与稳定效果，本研究可以为姜黄素在功能食品的应用中提供参考。