药食同源蔬菜赤苍藤SCoT 分子标记体系的优化及引物筛选

杨天为，黄诗宇，张尚文，高曼熔，张向军，李 婷，庾韦花，蒙 平，石 前

（1.广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所 南宁 530007； 2.广西大学农学院 南宁 530004）

赤苍藤（Erythropalum scandensBlume）为铁青树科赤苍藤属多年生常绿大型木质藤本植物，又称牛耳藤、萎藤、勾华、侧苋、细绿藤，主要分布在热带及亚热带地区，主产地位于华南地区以及贵州、云南等地的中低海拔区域。赤苍藤作为一种药用植物被收录在《广西药用植物名录》[1]中，它也是一种药食兼用的天然野生植物，嫩叶可作鲜食蔬菜，营养价值丰富、口味鲜美、清香独特；茎、根可作药材，茎可利尿医黄疸、治疗风湿骨痛，根可祛水肿，治疗跌打损伤[2]。近年来，随着赤苍藤的食用和药用价值获得人们认可，市场需求也日益增长，而我国热带和亚热带地区具有丰富的赤苍藤野生资源，有很大的开发潜力，目前，有关赤苍藤的研究主要是生产栽培技术[3-4]、品种选育[5]、化学成分分析[6-7]与药理作用[8]等方面，而有关赤苍藤种质资源评价与分类、遗传结构分析等方面的研究还未见报道，因此，对赤苍藤开展种质间遗传特性的深入研究可以为赤苍藤种质资源的收集与保护、品种选育与改良提供理论依据，对推进产业快速发展具有重要意义。

分子标记已经成为研究生物个体间遗传多样性的重要手段之一，较常用的分子标记方法有SSR、ISSR、SCoT 和AFLP 等[9-10]，其中SCoT 标记是根据基因组中ATG 翻译起始位点的侧翼有一段短的保守序列的原理进行引物设计，是一种通过单引物扩增目的基因的功能性分子标记[11]，正是因为这一原理，其与许多功能基因能够形成较多的引物结合位点，扩增的序列介于外显子与内含子之间，大幅度提升了引物的多态性。SCoT 与其他分子标记手段相比，SCoT 标记技术与供试材料的功能基因密切相关，更能反映相关功能性状的多态性，且所用引物简单、通用性强、扩增的条带稳定且多态性高，扩增产物能够通过琼脂糖凝胶电泳检测，操作简单方便、成本低，已经广泛应用在植物的遗传多样性、亲缘关系研究、种质资源鉴定与指纹图谱的构建等方面的研究中[10]。目前，SCoT 分子标记已经成功应用于龙眼[12]、芥菜[13]、葡萄[14]、葛根[15]、铁皮石斛[16]等植物的遗传多样性研究。

笔者以24 份不同来源地的野生赤苍藤种质为材料，通过正交试验设计方法建立并优化赤苍藤SCoT-PCR 反应体系，从SCoT 引物中筛选出稳定性好、多态性高、条带清晰的引物，为赤苍藤SCoT分子标记的应用研究奠定基础，同时也为今后赤苍藤种质资源评价、遗传多样性分析以及种质资源鉴定等方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2022 年4 月在广西壮族自治区农业科学院科研实验楼进行，试验材料为随机抽取的24份不同来源地的野生赤苍藤种质（表1），进行PCR体系优化与引物筛选，引物采用Collard 和Mackill公布的SCoT 分子标记引物SCoT-1～SCoT-36[11]，由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 24 份赤苍藤种质编号及来源地

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 的提取与检测 采用Biospin

全能型植物基因组DNA 提取试剂盒（BSC13S1B，杭州博日科技股份有限公司）提取不同来源地的赤苍藤叶片的DNA，使用超微量紫外分光光度计测定DNA 浓度和纯度，通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，提取的赤苍藤DNA 在-20 ℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 SCoT-PCR 反应体系优化 使用预扩增效果较好的SCoT-1 引物、Es 24 赤苍藤DNA 模板，对SCoT-PCR 反应体系中DNA 模板量、引物、2×EsTaqMaster Mix（CW0690M，康为世纪生物科技股份有限公司）3 个影响因素进行优化，每个因素设置3个水平，采用L9（33）正交试验（表2），每个处理2 次重复。PCR 扩增程序设置为：94 ℃2 min 预变性；94 ℃30 s 变性，57 ℃30 s 复性，72 ℃30 s 延伸，35次循环；72 ℃5 min 总延伸；反应体系为20 μL，DNA 模板、引物、2×EsTaqMaster Mix 用量按正交试验表添加，剩余用ddH2O 补足，PCR 反应结束后使用1.0%的琼脂糖凝胶检测扩增产物，拍照分析各反应条件的扩增效果。正交试验结果通过直观分析法[17]进行分析，根据扩增条带数量、清晰程度等进行评分，满分为9 分，分值越高代表扩增效果越好。计算每个因素不同水平下的评分平均值Ki，并求出同一因素不同水平间的评分平均值的极差R，R值越大表示影响程度越大，最终筛选出最适合的反应条件。

表2 正交试验因素及水平

1.2.3 引物初筛和退火温度筛选 以Es24 赤苍藤DNA 为模板，SCoT-1～SCoT-36 为引物，使用优化后的SCoT-PCR 反应体系进行初步筛选，并对初筛结果中扩增条带不清晰的引物设置退火温度梯度（48、51、53、57、60、63 ℃）进行复筛。挑选2 轮筛选中条带清晰，多态性高的引物用于SCoT-PCR 反应体系验证。

1.2.4 SCoT-PCR 反应体系验证 从筛选到的条带清晰、多态性高的引物中随机挑选3 个引物对24份赤苍藤DNA 模板验证筛选出的最佳反应体系，用1.0%的琼脂糖凝胶检测结果。

1.3 数据处理

使用SPSS 22.0 生成三因素三水平正交试验表，通过Excel 2016 计算平均值Ki和极差R。

2 结果与分析

2.1 SCoT-PCR反应体系优化结果

通过PCR 扩增结果（图1）看出不同的正交组合扩增的条带有较大差异，条带数量，清晰程度均有不同，其中处理8 的扩增效果最好，评分结果如表3 所示，通过R值判断3 个因素对赤苍藤SCoT-PCR 反应体系的影响程度排序为：DNA 模板量＞引物用量＞Mix 混合液用量，通过Ki值确定最优反应体系（20.0 μL）为1.0 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL 引物（10 μmoL·μL-1）、10.0 μL Mix 混合液和7.8 μL ddH2O。

图1 SCoT-PCR 正交试验电泳检测结果

表3 正交试验组合及评分

2.2 引物初筛与退火温度筛选结果

通过对SCoT-1～SCoT-36 引物的初步筛选以及部分引物退火温度的复筛，由图2 可知，不同退火温度对PCR 扩增的结果影响较大，退火温度越高，扩增的条带越少，不同引物的最适退火温度也不相同。以背景清晰、条带明亮、数量多的扩增结果确定最佳退火温度，淘汰各个退火温度下扩增效果均不太好的引物，最终确定表4 引物和退火温度适用于赤苍藤材料的SCoT-PCR 反应。

图2 部分引物的退火温度筛选电泳检测结果

2.3 SCoT-PCR反应体系验证结果

在筛选出的SCoT 引物中随机挑选了SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22 引物进行SCoT-PCR 反应体系验证（表4），以24 份不同来源地的赤苍藤材料DNA为模板，随机挑选的3 条引物均能扩增出背景清晰、多态性丰富的条带（图3），不同来源地的赤苍藤的扩增条带能够体现出差异，其中SCoT-2 共扩增11个位点，多态性位点11 个；SCoT-11 共扩增10 个位点，多态性位点6 个；SCoT-22 共扩增11 个位点，多态性位点9 个。结果表明，该SCoT-PCR 反应体系稳定可靠，可用于赤苍藤的SCoT 分子标记。

表4 适用于赤苍藤SCoT 分子标记的引物最适退火温度

图3 SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22 引物对24 份赤苍藤材料的SCoT-PCR 电泳检测结果

3 讨论与结论

SCoT 分子标记是一种与目的基因紧密关联的分子标记方法，它利用基因组中ATG 翻译起始位点侧翼的序列具有较高的保守性和一致性的原理，能够扩增相关功能基因，获得与性状紧密联系的分子标记[10-11]。准确、有效地应用SCoT 分子标记技术需要建立一个稳定可靠的SCoT-PCR 反应体系，而SCoT-PCR 反应受多个因素的影响，且不同材料的SCoT-PCR 反应体系的各因素对体系的影响是不同的[16，18-19]，因此需要通过正交试验优化研究材料的PCR 反应体系。通常SCoT 标记的反应体系中影响的因素为Mg2+、模板DNA、引物、DNA 聚合酶、dNTPs 等。尚小红等[20]、孙成成等[21]的研究通过对这5 个因素进行正交试验来完成SCoT-PCR 反应体系的优化，随着PCR Mix 混合液的应用，在PCR反应体系中5 个因素变为3 个因素，减少了试剂的添加步骤，使PCR 结果更为稳定可靠，重复性更好[22]。笔者试验使用的2×EsTaqMaster Mix 中含有Mg2+、dNTPs、DNA 聚合酶，这些因素会影响PCR扩增结果，也需要通过设置梯度探索适用于赤苍藤的反应条件。邵征绩等[16]、娄永峰等[23]通过Mix 混合液、模板DNA、引物3 个因素进行正交试验获得了铁皮石斛和陈山红心杉SCoT-PCR 的最优反应体系。笔者通过三因素三水平正交试验优化SCoT-PCR 反应体系，结果表明，3 个因素对赤苍藤SCoT-PCR 反应体系的影响程度排序为：DNA 模板量＞引物用量＞Mix 混合液用量，与黄晓慧等[24]的中国兰的体系优化研究结果一致，但与铁皮石斛[16]、沙棘[18]、陈山红心杉[23]的研究结果有所差异，说明反应体系的影响因素因植物材料的不同，结果表现也不相同。

在PCR 反应条件中，退火温度也是重要的影响因素，温度过高会致使引物与DNA 模板结合差、多态性低、条带少，而温度过低则会导致引物与DNA模板的非特异性结合，影响试验结果[25]。因此，笔者通过对SCoT 引物设置退火温度梯度筛选，进一步优化SCoT-PCR 反应条件，确定了该反应体系下引物的最适退火温度，使结果更为准确可靠，有利于后续相关研究工作的开展。

笔者采用正交试验筛选出SCoT-PCR 反应影响因素的最佳条件，并利用该反应体系筛选出适用于赤苍藤的SCoT 标记引物，再通过不同地理位置分布的赤苍藤种质材料对该反应体系进行验证，最终确立赤苍藤SCoT-PCR 最优反应体系为1.0 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL 引物（10 μmol·μL-1）、10.0 μL Mix 混合液和7.8 μL ddH2O。笔者共筛选了SCoT-1、SCoT-2 等14 条引物，确定了该反应体系下14 条引物的最适退火温度，为后续开展赤苍藤种质资源收集与保护、遗传多样性研究和分子育种提供参考依据。