棘阿米巴感染治疗药物的研究进展*

王月华,鞠晓红

(吉林医药学院检验学院,吉林 132013)

棘阿米巴属是广泛存在于自然界的自由生活的阿米巴,为兼性寄生原虫,主要致病虫种有卡氏棘阿米巴(A.castellanii)和多噬棘阿米巴(A.polyphaga),可经破损的皮肤黏膜或角膜侵入人体,引起棘阿米巴性皮肤损害、棘阿米巴性角膜炎(Acanthamoebakeratitis,AK)和肉芽肿性棘阿米巴脑炎(granulomatous amoebic encep-halitis,GAE)。AK是一种严重的致盲性角膜感染,宿主细胞的炎症反应是致病的主要因素;GAE是致命的中枢神经系统感染,主要发生于免疫功能低下人群(器官移植、艾滋病等),致死率高,为95%～98%[1]。

棘阿米巴的生活史包括活动期和休眠期2个阶段,分别以滋养体和包囊形式存在。滋养体是原虫的活动和增殖阶段,包囊是不利环境下的休眠形式,有内、外双层囊壁,对多种理化因素有极强抵抗力,是棘阿米巴感染复发的主要原因,也使感染治愈困难。棘阿米巴的致病机制尚未完全清楚,由于抗药性和2种生存形式的相互转变使其治疗十分棘手。目前,保守的药物治疗仍是应用最广泛的治疗棘阿米巴感染的方法,但缺乏特效针对性。近年来,人们在深入探讨其致病机制的基础上,不断寻求有效的药物治疗策略,积极开发新药物,如纳米药物、树枝状大分子药物等,致力于精准靶向治疗,提升疗效,降低毒副作用。笔者针对抗棘阿米巴感染的治疗药物综述如下。

1 抗细菌类药物

在棘阿米巴感染治疗中,多种抗细菌类药物可以与抗阿米巴药物联合使用提升治疗效果,如多西环素、硝基咪唑类、利福平、复方磺胺甲叶恶唑、美罗培南、利奈唑胺、莫西沙星、磺胺嘧啶等[2-3]。

1.1多西环素 多西环素属于半合成的四环素类药物,能与细菌核糖体30s亚基A位点结合,阻止氨基酰tRNA进入,从而抑制肽链延伸和细菌蛋白质合成;其次,还可引起细胞膜通透性改变,使胞质内重要成分外溢导致细胞死亡;同时还具有抗炎和免疫调节作用。多西环素的抗炎作用是其用于棘阿米巴感染治疗的主要机制,药物通过抑制宿主细胞的炎症反应减轻棘阿米巴造成的组织损伤间接发挥治疗作用,故多西环素需与抗棘阿米巴药物联合使用。

多西环素是多效抗炎剂,其主要作用机制可能是作为一种非特异性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)抑制剂。该药能与MMPs活性中心结合抑制其转录,通过阻止MMPs过度表达抑制炎症因子大量产生,从而降低角膜的炎症反应,抑制溃疡形成[4]。MMPs是一大类金属锌离子依赖的内肽酶家族,分为5类包括60多个成员,其中明胶酶MMP-2、9和胶原酶MMP-8被认为在角膜炎性细胞浸润和炎症的发展中发挥重要作用,参与角膜基质的降解破坏,与疾病进程密切相关[5-6]。体外实验研究显示[7],用阿奇霉素和多西环素处理接种有棘阿米巴原虫的人角膜组织模型,可有效抑制炎症递质白细胞介素-6表达,降低细胞损伤,说明二者可作为抗棘阿米巴感染治疗的佐剂,减轻角膜损伤。程璞等[8]研究抗阿米巴药物联合多西环素对 AK大鼠模型的作用发现,用0.02%醋酸洗必泰联合0.02%多西环素眼液滴眼,与对照组比较,感染第3、5、7天患鼠的MMP-8 基因表达量显著下降(P<0.05),炎症指数明显低于对照组,但第10天差异无统计学意义,说明感染早期治疗效果显著。

1.2硝基咪唑类 硝基咪唑类药物属于人工合成抗菌药,为2-甲基5-硝基咪唑衍生物,主要成员包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑、塞克硝唑等,对厌氧菌、滴虫、阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫等均具强大活性。药物分子中的硝基在细胞内的无氧环境中被还原成氨基和(或)形成自由基等细胞毒物质,与病原体的DNA和酶非特异性结合,使其灭活促使细菌死亡。抗阿米巴原虫机制为干扰其氧化还原反应,使氮链断裂杀死原虫,如甲硝唑和替硝唑能杀死宿主组织和器官中阿米巴滋养体,安全强效。

甲硝唑单用无抗棘阿米巴活性,但其磷盐衍生物在体外显示强大的抗棘阿米巴活性,作用48 h最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)是单独使用甲硝唑的1/20,滋养体细胞出现圆缩、伸长、膜受损、病理性伪足等明显形态改变,提示甲硝唑的磷盐衍生物具有潜在的治疗价值[9]。甲硝唑与两性霉素B联合制备的纳米药物在50 μg·mL-1浓度时,对卡氏棘阿米巴的滋养体和包囊均有明显抑制作用,不影响鼠和人类细胞[10]。以上研究提示,对疗效不佳的传统抗棘阿米巴药物的改进及探索联合用药策略具有潜在的发展空间。

采用以上药物联合治疗或局部角膜病灶清创术后结合药物治疗多能取得较好的治疗效果,但持续治疗时间较长,数月方可使眼痛、畏光、流泪等症状好转,角膜浸润好转,溃疡缩小,视力提高,从而减少患者角膜移植率。

2 抗真菌药物

目前,用于棘阿米巴感染治疗的真菌类药物主要有唑类和多烯类药物。

2.1唑类抗真菌药 唑类抗真菌药根据结构分为咪唑类和三唑类,均为人工合成的广谱抗真菌药物,具有活性强、生物利用度高、半衰期长等优点。常见的有酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、咪康唑、克霉唑等,通过抑制麦角甾醇生物合成的关键步骤——细胞色素P450依赖的14α- 赖氨酸甾醇合成,从而破坏真菌细胞膜。由于棘阿米巴原虫和真菌细胞膜有类似的甾醇类物质,麦角甾醇也是棘阿米巴甾醇生物合成的主要终产物,故此类抗真菌类药物也具有抗棘阿米巴活性。

伏立康唑通过抑制棘阿米巴原虫的甾醇14α-去甲基化酶CYP51阻碍麦角固醇合成,进而抑制滋养体增殖,表现出强大的抗虫作用,被认为是治疗AK的有效药物[11]。口服伏立康唑联合米替福新能显著降低GAE患者的脑损伤[3]。美因茨大学医学中心眼科对26例AK患者进行1%伏立康唑联合0.02%聚六亚甲基双胍(polyhexamethylene biguanide,PHMB)或0.1%和异硫氰酸丙脒(brolene)治疗,25例治疗有效[12]。同样原因,唑类抗真菌药对于其他原虫感染也有一定效果,如酮康唑目前用于治疗皮肤利什曼病,酮康唑、伊曲康唑在体内外对克氏锥虫均显示出强大的抗增殖活性。不同唑类药物的抗虫活性和毒副作用各有不同,若能在现有研究基础上合成唑类药物文库,筛选出更有效的针对棘阿米巴感染的治疗策略意义重大。另外,通过先进的纳米技术,如物理或化学方法,将唑类加载到纳米颗粒载体上实现靶向治疗,可显著提高药物的药动学和治疗指数。

2.2多烯类药物 用于抗棘阿米巴的多烯类抗真菌药主要有两性霉素B和制霉菌素,通过结合细胞膜的麦角甾醇破坏膜结构,使细胞内容物外溢导致细胞溶解、死亡。体外实验显示[13],两性霉素B对棘阿米巴的生长抑制作用具有时间和剂量依赖性,浓度达到10.0 mg·L-1时可杀伤包囊。若将多烯类药物制备成纳米药物抗虫活性更强,如制霉菌素与银纳米粒子结合而成的纳米药物在5 μmol·L-1即可发挥效应。

3 双胍类

目前,双胍类和二胺类(丙烷脒异硫氰酸、六甲胺)组合已被临床作为治疗棘阿米巴的一线药物,0.02%双胍类和0.1%二胺类联合用药是常用治疗方案[14]。双胍类主要作用于阿米巴的胞质膜,导致膜损伤、溶解和死亡,二胺类通过阻断蛋白质和核酸的生物合成发挥抗虫作用。其中,双胍类氯已定(chlorhexidine)和聚六亚甲基双胍盐酸盐(polyhexame-thylene biguanidine hydrochloride,PHMB)是治疗AK的最常见药物。但PHMB对人角膜细胞有毒性,具有导致中毒性角膜病变等毒副作用的风险。

3.1氯己定 氯己定属于双胍类阳离子广谱消毒剂,是抗阿米巴的常用药物之一,对棘阿米巴感染有一定疗效,其作用机制:一是药物进入棘阿米巴细胞后通过络合胞内ATP、核酸等干扰DNA功能;二是能吸附在胞膜的磷脂上破坏细胞膜结构、改变包囊壁通透性,导致胞质内容物外漏、死亡[15]。因此,氯己定对棘阿米巴滋养体和包囊均有杀伤作用,但单独用药效果有限,常采取联合给药方式。

AK病程早期,0.02%氯己定滴眼液联合伊曲康唑胶囊再配合玻璃酸钠滴眼液的治疗方案,临床治愈率达66.7%[16]。氯己定与丙脒异硫氰酸酯、甲氧嘧啶、新霉素联合治疗AK,如果在感染早期给予治疗,亦有显著效果。氯己定若与金纳米粒子合成纳米药物则活性显著高于单独用药,如采用硼氢化钠还原法合成的氯己定共轭金纳米粒子对棘阿米巴滋养体具有活性显著。

3.2PHMB PHMB是一种新型高分子杀菌剂,具有广谱、长效、毒性低、不刺激皮肤黏膜等优点,主要作用机制是通过跨膜转运作用于细胞质中磷脂双分子层,改变细胞膜通透性,破坏细胞代谢,作为治疗AK的有效药物得到广泛应用。朱智勇等[17]采用0.02% PHMB溶液局部点眼(0.5 h1次)联合抗菌药物进行临床治疗AK,感染早期患者治疗有效率57.1%,进展期患者可采用氯己定联合PHMB治疗。基于PHMB、丙脒异硫氰酸酯和新霉素的三联疗法用于AK的治疗也有显著效果[18]。

4 新型制剂

目前新型制剂主要包括纳米粒子(nanoparticles,NPs)和树枝状大分子(dendrimers),与抗棘阿米巴药物结合,实现靶向给药,提高药物在体内的生物利用度。

4.1NPs NPs又称超细微粒,是指粒度1～100 nm、由数目不多的原子或分子组成的粒子集团。由于NPs表面活性中心多,为其做催化剂提供了必要条件,故在工业、医学、生物工程、材料制备等方面用途广泛。NPs能够在全身循环,被细胞表面受体识别,诱导细胞内吞形成吞噬小泡进入细胞内部,吞噬小泡再与溶酶体融合,水解后释放药物发挥作用,因此能携带药物到体内特定位点,成为转运药物的理想载体[19]。基于此,NPs被认为是新一代的抗细菌、抗病毒和抗真菌制剂。目前已成功开发了以纳米磁性材料为药物载体的靶向药物,称为“生物导弹”,具有高效低毒的特点。

大多数抗寄生虫药物溶解度差、半衰期短,使其生物利用度低,治疗效果事倍功半。NPs能够克服传统药物的不足,提高药物在体内的生物利用度、加强缓释性和细胞内的通透性,通过NPs的载体效应靶向转运药物、快速清除体内寄生虫,成为解决寄生虫病药物治疗难题的有效路径。NPs的抗寄生虫有效性已在多种不同原虫的试验中得到证实[20-21]。

在抗棘阿米巴原虫的合成纳米药物研究中,使用最为广泛的金属材料是金纳米粒子(AuNps)和银纳米粒子(AgNps))。AuNps或AgNps结合药物(胍那苄、地西泮、苯巴比妥、氯己定等)或某些天然化合物(如单宁酸、肉桂酸、植物胶等)后在体外对卡氏棘阿米巴显示出强大的抗虫活性[22]。HENDIGER等[23]使用硝酸银经化学还原法制备单宁酸修饰的AgNps,在体外抗棘阿米巴活性增强,而细胞毒性不增加。由于棘阿米巴细胞膜中磷脂含量达25%,油酸是构成磷脂的最主要脂肪酸之一,因此在油酸存在下,利用硼酸钠还原硝酸银溶液制备的油酸型共轭AgNps不仅具有明显的抗棘阿米巴细胞(滋养体和包囊)活性,还能显著抑制由阿米巴介导的细胞毒性[24]。胍那苄(guanabenz,GNB)是一类能通过血脑屏障治疗高血压的药物,将GNB与银纳米粒子结合制备而成的纳米药物,5 μmol·L-1浓度即能将卡氏棘阿米巴虫体数从5.9×105降到9.3×104(单独用药仅下降到3.8×105),并能显著抑制包囊转变成滋养体的出囊过程,HaCa T细胞毒性试验表明对人类毒性显著减弱[25]。上述研究显示,GNB-银纳米粒子是治疗GAE的理想药物,具有广阔的开发前景。

此外,钴纳米粒子(CoNps)对临床分离的棘阿米巴也显示出良好的抗虫活性。其中,Co3(PO4)2纳米粒子的抗虫活性最为强大,浓度100 μg·mL-1的CoNps能使卡氏棘阿米巴的存活率下降70%[26]。其他的纳米材料还有二氧化钛、氧化铜、氧化锌、氧化汞等,体外试验虽有一定抗棘阿米巴活性,但确切作用机制和对人类细胞系的细胞毒性尚未明确,有待进一步研究证实。

纳米药物的抗棘阿米巴活性虽已明确,但作为主要纳米材料的金、银等金属对人体细胞的毒性亦不可轻视,必须进行安全评估预测其细胞毒性才能真正实现纳米治疗。

4.2树枝状大分子 树枝状大分子是一类三维结构、高度支化的新型大分子,因外形酷似树枝而得名。其中,硅碳烷树枝状大分子(carbosilane dendrimers)是以Si-C键为骨架的一类大分子,目前研究最多。通过将某些药物键接在树枝状大分子的适宜部位,赋予其新的功能或改变官能团的特性,能够实现纳米给药、缓释、降低毒副作用等独特优势,因而在医学领域显现出广阔前景,成为某些疾病治疗的研究热点。

在体外,用合成的双胍树枝状聚合物处理棘阿米巴滋养体后,滋养体发生明显的形态变化,出现体积缩小、棘足缺失等,随后进行活性分析和超微结构观察,结果显示双胍树枝状大分子聚合物可通过裂解棘阿米巴原虫的细胞膜阻止成囊,进而杀灭滋养体[27-28]。葡萄糖酸氯己定与碳硅烷树枝状聚合物联合使用显示出良好的协同效应,不仅能有效降低滋养体浓度,对包囊也有明显作用[15]。

5 其他

许多植物代谢物如单宁、黄酮、生物碱或萜类等也具有抗寄生虫活性。其中,单宁研究较多。单宁是多酚类植物代谢产物,具有减肥、降血糖、抗氧化和抗菌活性。单宁酸修饰的银纳米粒子(AgTANPs)与单独的AgNps、AuNps比较,AgTANPs更容易进入棘阿米巴滋养体抑制虫体转变成包囊。此外,烷基磷酸胆碱化合物,如十六烷基磷酸胆碱,也具有抗棘阿米巴特性且有通过血脑屏障的能力,可用来治疗GAE感染。

6 结束语

综上所述,在众多抗棘阿米巴的药物中,双胍类(氯己定、PHMB)作为抗棘阿米巴治疗的一线药物,在临床实践中取得了较好的治疗效果,特别是与其他药物联合应用。单一用药治疗棘阿米巴感染效果有限,通常采用多种药物联合疗法[29]。药物治疗中所面临的挑战:一是表现出不同程度的毒副作用;二是棘阿米巴一旦转换成休眠形式包囊,则更增加了药物治疗难度;三是治疗GAE时还需考虑药物能否通过血脑屏障达到有效治疗浓度。因此,开发靶向性治疗药物成为对抗棘阿米巴感染的关键。棘阿米巴在成囊、出囊过程中具有独特的信号通路和酶,如细胞周期蛋白(CDK和CDC2b)、凋亡蛋白caspase、自噬相关蛋白、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等,为研发抗棘阿米巴分子药物提供了潜在作用靶点。