MAPKs通路在九香虫提取液对锰致大鼠睾丸损伤中的作用

熊可艺,吴文慧,邓源林,范晓莉,梁程敏,王凤月,侯晓晖

(遵义医科大学 细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099)

世界卫生组织预测，21世纪不孕不育将成为继肿瘤和心脑血管疾病之后的第三大顽疾，因此不孕不育症等人群的生殖情况被看作是全世界范围内须重点关注的公共卫生问题[1]。据统计，全球不孕不育的夫妇约占育龄人口的8%～12%，其中男性因素约占50%[2]。随着现代社会不断发展进步，环境污染、精神压力以及不良的生活方式等均可导致男性内分泌紊乱，使其生育力下降，不育症发病率显著增加[3]。锰是一种广泛存在的环境毒物，人们在生活中接触到的许多物品如电池、汽油和农药等都添加了金属锰，这在很大程度上增加了锰暴露的机会[4]。已有研究证实，过量的锰摄入会导致严重的神经毒性和生殖毒性，甚至造成死亡，常见于职业性锰中毒[4-5]。在高剂量染锰大鼠模型中，其睾丸重量、精子浓度及血清睾酮明显减少[6-7]。此外，当人体在高浓度锰暴露时也会导致精子浓度下降和活力降低[8]。

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases)是细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可参与细胞的基因转录、分化和增殖、周期调控、凋亡及炎性反应等多种生理过程[9]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，包括ERK(细胞外调节蛋白激酶，Extracellular regulated protein kinases)、JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase)以及p38，它们受不同的信号通路途径调节，从而控制细胞的生理活动[10]。通常认为生长因子和细胞因子可激活ERK来调节细胞的增殖和分化，而JNK和p38则容易被环境因素所激活，进而控制细胞的生存或死亡[11]。在附睾中，成熟精子的生成和凋亡、运动、获能及顶体反应等都依赖于MAPK信号通路家族的调节[12]。

九香虫(Coridiuschinensis)是我国传统的药用昆虫，用于治疗阳痿、不育、射精障碍、肾虚、勃起障碍等疾病[13-14]。现代医药学研究证实九香虫具有镇痛、抗氧化、抗癌、抗凝血和抗细菌等多种药理活性[13]。研究发现，九香虫能在一定程度改善锰暴露带来的雄性大鼠生殖损伤，提升睾酮水平、精子浓度以及捕捉、射精次数等性行为能力[15]。目前，九香虫提取物(CoridiuschinensisExtract,CcE)拮抗染锰大鼠睾丸损伤作用的机制尚不十分明确，Liu等[16]提出通过抑制睾丸组织的氧化应激水平进而降低生殖细胞的凋亡发生。Cen等[17]研究表明九香虫提取物干预锰暴露引起的大鼠睾丸生精功能障碍和生殖细胞凋亡，发现c-Src和FAK可能参与了九香虫对睾丸损伤的修复作用，通过体外实验发现九香虫小分子化合物可以改善锰导致的小鼠TM4细胞损伤，其作用机制与PI3K/c-Src/FAK信号通路有关[18]。金匮肾气丸是《金匮要略》中的方剂之一，所谓“肾为阴、气为阳”，表明该方以补益肾气为主，故选该成品药作为阳性对照[19]。因此，九香虫对锰致大鼠生殖损伤的保护作用及机制还需深入研究，而MAPKs信号通路在锰暴露及九香虫干预中的作用鲜有报道。本研究利用九香虫石油醚提取液和金匮肾气丸水溶液对锰暴露大鼠进行干预，通过睾丸组织形态学以及MAPKs信号通路上相关基因、蛋白的表达情况，探究该信号通路在九香虫提取物拮抗大鼠生殖损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠(8周龄)60只购自第三军医大学大坪实验动物中心 [许可证号：SCXK(渝)2012-0005]。饲养环境光照和黑暗交替12 h进行，每日给予固定饮食，自由饮水。本研究获得遵义医科大学伦理学委员会批准。

1.2 实验主要试剂及仪器 中药九香虫(遵义市百颐医药公司)；MnCl2·4H2O(中国医药集团)；金匮肾气丸(北京同仁堂)；p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；HRP(辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase)标记山羊抗兔、山羊抗鼠抗体(Proteintech公司)；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(日本TaKaRa Bio公司)；SYBR Green qPCR Master Mix(MCE (MedChemExpress) 公司)，BCA(聚氰基丙烯酸正丁酯，bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，其余试剂为国产分析纯。

1.3 九香虫提取液制备 将200 g九香虫粉末溶于7倍体积石油醚中，充分搅拌并冷浸，次日取上清进行过滤、旋转蒸发及冷冻干燥，得干燥九香虫浸膏，最后用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成100 mg/mL的九香虫提取液，完全溶解后保存于-20 ℃冰箱，实验时再配制成所需浓度。

1.4 造模及干预实验 将60只雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、九香虫提取液低、中、高剂量组和阳性组，每组10只。造模实验：空白对照组腹腔注射生理盐水1 mL，其余各组按照15 mg/kg BW(体重)腹腔注射MnCl2溶液(7.5 mg/mL)，连续给药30 d；干预实验：空白对照组灌胃双蒸水1 mL，九香虫提取液低/中/高剂量干预组分别按照50、100、200 mg/kg BW灌胃九香虫提取液，阳性组按照1.25 g/kg BW灌胃金匮肾气丸水溶液，与造模实验同步进行[13]。大鼠末次给药后于第2天断头处死，取出双侧睾丸，分别保存于4%多聚甲醛或液氮中，用于后续实验。

1.5 HE染色 睾丸组织采用常规方法制备石蜡切片，通过脱蜡、苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水透明及封片等步骤进行染色，晾干后于光镜下观察大鼠睾丸生精小管、间质组织和生精细胞的结构完整性及排列情况。

1.6 实时荧光定量PCR检测 首先，用Trizol法提取大鼠睾丸组织总RNA；然后，用Prime Script TMRT Reagent Kit试剂盒进行RNA逆转录合成cDNA；最后，参考SYBR Green qPCR Master Mix说明书进行Real-Time PCR，配制10μL体系并用三步法PCR反应检测ERK1、JNK1、p38 mRNA的相对表达量，以ACTIN作为内参。以空白组mRNA的表达量作为“1”，再根据校正值计算出其他各组mRNA相对含量，进行组间相对量的比较。分析实验的Melt Peak图，确定各基因只有单一峰后，以循环阈值(Ct)为参数计算目的基因的相对表达量，使用2-ΔΔCt法分析mRNA的相对表达水平(引物序列见表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 蛋白质印迹法检测MAPK通路中相关蛋白的表达 按照常规方法[13]提取睾丸组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，统一蛋白浓度后进行上样、电泳、转膜及封闭等步骤，加入一抗：p-p38(1∶2 000)、p38(1∶2 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、p-JNK(1∶2 000)、JNK(1∶2 000)单克隆抗体、β-actin内参，4 ℃孵育过夜，加入二抗：HRP标记的山羊抗兔、抗鼠抗体(1∶2 000)室温孵育2h，最后加入增强型化学发光工作液后于Bio-Rad凝胶成像系统进行曝光，保存图片。利用Image Pro Plus软件和Graph pad Prism进行图像分析。

2 结果

2.1 睾丸组织HE染色 光镜下可见空白对照组睾丸生精小管和间质结构完整且排列紧密，各级生精细胞排列齐整、层次分明，睾丸间质组织可见成簇分布的间质细胞和丰富的毛细血管(图1A、G)。与对照组相比，模型组睾丸生精小管结构遭到破坏，萎缩变形，生精小管间隙明显增宽，各级生精细胞层数减少，间质组织明显减少且连接中断(图1B、H)。九香虫提取液各剂量干预组和阳性组睾丸组织形态结构趋于正常，随着九香虫提取液剂量增加，生精细胞层数逐渐增加、小管细胞排列有序且成熟精子数量明显增加，间质细胞也逐渐增多(图1C-F、I-L)。形态学结果表明不同浓度的九香虫提取液和金匮肾气丸水溶液可干预锰对大鼠睾丸组织显微形态结构的损伤。

A,G:空白对照组;B,H:模型组;C-E,I-K:CcE低、中、高剂量干预组;F,L:阳性组，A-F为×10，G-L为×40。图1 CcE对锰暴露雄性大鼠睾丸组织形态学的影响

2.2 MAPK通路关键基因mRNA表达水平 采用qPCR技术检测MAPK相关基因p38、ERK1和JNK1 mRNA表达水平，以空白组大鼠各基因的mRNA表达水平为参照。与空白组相比，模型组大鼠睾丸组织中JNK1和p38 mRNA的表达显著上调(分别是P<0.001和P=0.0106，P均<0.05)，而ERK1 mRNA的表达则显著下调(P<0.001)。与模型组相比，不同剂量CcE干预组和阳性组大鼠睾丸中MAPK相关基因JNK1、p38 mRNA的表达显著下调(P<0.001)，而ERK1 mRNA则显著上调(P<0.001)，差异均具有统计学意义(见表2、图2)。

表2 CcE 对锰暴露雄性大鼠睾丸组织ERK1/JNK1/P38 mRNA 表达的影响

除表中给出的P值外，其余差异P均<0.001。*：与空白组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。a：与低剂量组比较，P<0.05；b：与中剂量组比较，P<0.05；c：与高剂量组比较，P<0.05。

*：与空白组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。图2 CcE对锰暴露雄性大鼠睾丸组织ERK1/JNK1/p38 mRNA 表达的影响

2.3 MAPK通路相关蛋白表达量变化 Western blot检测MAPK通路相关蛋白p38、ERK1/2、JNK及其磷酸化蛋白的表达水平。与空白组相比，锰中毒可导致大鼠睾丸组织中p-p38和p-JNK相对表达量显著增加(P<0.001)，而p-ERK1/2相对表达量显著降低(P<0.001)。与模型组相比，经过不同剂量九香虫提取液和金匮肾气丸水溶液干预后，大鼠睾丸组织中的p-p38和p-ERK1/2蛋白相对表达量均显著降低(P<0.001)，而p-ERK1/2蛋白相对表达量则显著增加(P<0.001)，差异均具有统计学意义(见图3)。上述结果表明不同浓度的九香虫提取液和金匮肾气丸水溶液可抑制p38和JNK的过度磷酸化，上调ERK1/2的磷酸化水平，有助于减少生殖细胞凋亡，改善锰对大鼠睾丸组织的损伤。

A：MAPK相关蛋白表达条带；B：p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达量；C：p-JNK/JNK蛋白表达量；D：p-p38/p38蛋白表达量。a：空白对照组；b：模型组；c：CcE低剂量组；d：CcE中剂量组；e：CcE高剂量组；f：阳性组；*：与空白组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。图3 CcE对锰暴露雄性大鼠睾丸组织ERK1/2、JNK和p38蛋白表达量的影响

3 讨论

锰是一种存在于自然环境中的过渡金属，也是体内多种酶的活性中心，随着工业的发展人们越来越多地暴露于含锰的空气和灰尘中[20-21]。虽然正常的精子功能需要一定量的锰，但研究表明过量的锰会对男性生育能力产生不利影响，主要见于职业性锰中毒[22]。据流行病学调查显示，部分男性工人在从事锰相关职业后会出现阳痿、早泄、性欲改变、生精困难等症状[23]。据报道，锰导致器官损伤的关键机制是细胞产生ROS和线粒体损伤使细胞凋亡，ROS通过诱发过氧化导致损伤，造成Ca2+在细胞内积聚，从而导致细胞凋亡[24-28]。

MAPKs信号通路参与细胞的生长繁殖、分裂死亡及各种生化反应信号的传递过程，主要包括p38 MAPK、JNK和ERK三条信号通路[29]。研究发现，JNK和p38 MAPK的激活会促使细胞凋亡，而ERK的激活会抑制细胞凋亡[30]。ERK总体上被认为是存活调节因子，能促使细胞生长，对抗细胞死亡，而JNK、p38 MAPK可诱导细胞死亡及炎性反应[31]。本研究中锰离子可破坏大鼠睾丸组织的形态结构及完整性，导致MAPKs信号通路上参与调控细胞凋亡的关键性激酶p-JNK和p-p38的表达水平上调，进而下调p-ERK的表达。由此表明锰等环境毒物通过激活MAPK信号通路，引起生殖细胞的损伤和凋亡，导致精子生成数量减少，最终导致男性不育。

九香虫作为多种中药方剂的组方药物，用于治疗阳痿、疼痛和神经衰弱等疾病[13]。据报道，九香虫提取物具有保护生殖器官、提高生殖能力的作用，可明显改善锰暴露大鼠支持细胞的形态结构，抑制锰暴露引起的血睾屏障损伤[17]。同时，九香虫水提液还可维持大鼠的睾酮产量，调节神经-生殖轴来保护睾丸的结构和功能[32]。从九香虫中分离出的多巴胺衍生物对糖尿病肾病具有一定的保护作用[33]。此外，肾气丸具有寒温并用、补泻同施和滋阴补阳等特点，临床上凡契合肾气丸组方思路的疾病均可应用该药治疗[19]。金匮肾气丸为我国传统补肾名方，具有滋补肾阴和温补肾气的功效[34]。朱思晗等[35]研究发现金匮肾气丸能够增加伊马替尼在血液中的浓度，提高后者治疗慢性粒细胞白血病的靶向性作用，减少其在睾丸组织中的浓度，从而降低伊马替尼对雄性小鼠的生殖毒性，具有一定的生殖保护作用。

为了探明MAPKs通路在九香虫保护锰中毒大鼠生殖功能中的作用，本研究关注不同浓度九香虫提取液和金匮肾气丸水溶液，发现二者均能下调MAPKs信号通路中p-p38和p-JNK的基因和蛋白表达量，表明其能通过降低JNK和p38的磷酸化水平来抑制凋亡的持续发生，进而保护锰致生殖细胞的损伤和凋亡。这与Ki等[36]研究发现氧化应激可以激活MAPK通路，而JNK和p38可以通过产生ROS和上调COX-2来促进细胞调亡和炎症反应相一致。此外，本研究中p-ERK/ERK的基因和蛋白表达水平均随着九香虫提取液浓度的增加而升高，这与Liu等[37]研究发现ERK具有抗凋亡作用，后者在细胞存活中发挥重要作用相一致。另有研究发现，p-ERK在损伤时呈现出先升高后降低，尤其在6h为最高，可能通过促进细胞凋亡来减弱对组织的损伤作用[38]。在本研究中，九香虫提取液干预锰暴露后，ERK的磷酸化水平增加，说明其参与了抑制细胞凋亡的发生。ERK的激活可以上调Bcl-2等抗凋亡蛋白的表达，还能诱导其活化，而阻断ERK活化后，就能减少Bc1-2的表达[39]。因此，本研究中利用九香虫提取液和金匮肾气丸水溶液来保护锰暴露大鼠睾丸组织的损伤，其作用机制可能是通过减少JNK、p38的磷酸化水平来降低生殖细胞凋亡的发生，同时通过增加ERK的磷酸化水平来促进生殖细胞增殖。

综上所述，本研究证实九香虫的干预可改善锰致大鼠睾丸组织的损伤，其中JNK和p38的磷酸化水平显著降低、p-ERK显著增加，间接提示MAPKs可能参与了九香虫对锰致睾丸损伤的保护，但仍需进一步深入研究。